Гибридологический анализ на Drosophila melanogaster: Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям по генетике для студентов факультета ветеринарной медицины и биотехнологий

42 Pages·2016·0.565 MB·Russian

by  Коллектив авторов

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации
ФГБОУ ВО Вологодская государственная молочнохозяйственная
академия имени Н.В. Верещагина
Факультет ветеринарной медицины и биотехнологий
Кафедра зоотехнии и биологии

ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
на Drosophila melanogaster

Учебно-методическое пособие
к лабораторным занятиям по генетике
для студентов факультета ветеринарной
медицины и биотехнологий

Вологда – Молочное
2016
УДК 595.7(07)
ББК 28.691.89 я 73
Г-467

Рецензенты:
докт.биол.наук, профессор кафедры зоотехнии и биологии А.Г. Кудрин,
канд. с.-х. наук, доцент кафедры зоотехнии и биологии Т.С. Кулакова
канд. с.-х. наук, доцент кафедры растениеводства, земледелия и агрохимии О.В. Чухина

Составитель: Хабарова Г.В.

Гибридологический анализ на Drosophila melanogaster: учебно-методическое
пособие / Сост. Г.В. Хабарова. – Вологда - Молочное: Вологодская ГМХА, 2016. - 42 с.

Учебно-методическое пособие предназначено для организации лабораторных
работ по гибридологическому анализу при изучении курса «Генетика и биометрия»
бакалаврами по направлению подготовки 36.03.02 «Зоотехния», по разделам
«Закономерности наследования признаков при половом размножении» и «Генетика
пола», при изучении курса «Ветеринарная генетика» по направлению подготовки
36.05.01 «Ветеринария» по разделам «Закономерности наследования признаков при
половом размножении» и «Генетика пола», по дисциплине «Генетика растений и
животных» по направлению подготовки 35.03.07 «Технология производства и
переработки сельскохозяйственной продукции» по разделу «Закономерности
наследования признаков при внутривидовой гибридизации».
Учебно-методическое пособие рассмотрено и утверждено на заседании
методической комиссии факультета ветеринарной медицины и биотехнологий
Вологодской ГМХА им. Н. В. Верещагина (протокол № __ от __________ 201__ года).

УДК 595.7(07)
ББК 28.691.89 я 73

Хабарова Г.В.
Вологодская ГМХА, 2016
2
Введение

Без знания закономерностей наследования признаков и свойств
организмов, размножающихся половым путем, невозможна успешная
селекция животных и растений, в том числе на повышение устойчивости к
различным заболеваниям.
Гибридологический анализ – это один из основных методов
генетики. Он заключается в изучении закономерностей наследования
признаков при скрещивании родительских особей, различающихся по
одному или нескольким признакам. Гибридологический метод был
разработан Г.Менделем в 1865 г. и предусматривает строгий выбор
объектов для скрещивания и количественный анализ полученного
потомства.
Организация учебного процесса по генетике показала, что
гибридологический анализ очень удобно проводить на плодовой мушке -
дрозофиле (Drosophila melanogaster). Дрозофила используется, как
модельный объект для различных генетических исследований уже более
ста лет. Широкое использование дрозофилы для гибридологического
анализа обусловлено ее биологическими особенностями, такими как
короткий цикл развития (10-14 дней), высокая плодовитость, многообразие
естественных популяций и мутантных линий мушки.
На кафедре зоотехнии и биологии Вологодской ГМХА для изучения
законов наследования признаков имеется пять мутантных линий
Drosophila melanogaster, поддерживаемых в культуре.
Студенты на занятиях знакомятся с биологией и морфологией
дрозофилы, а также с оборудованием и инструментами для разведения
мушки, используемым рецептом питательной среды, познают основные
правила работы с дрозофилой, ставят опыты по моногибридному,
дигибридному скрещиванию и наследованию, сцепленному с полом до
второго поколения, проводят анализирующее скрещивания и изучают
полученное потомство в F , F , F , выявляют соответствие полученных
1 2 анал.
данных теоретически ожидаемым.

3
1. Дрозофила как объект генетических исследований

Цель занятия: Изучить биологические и морфологические
особенности дрозофилы, особенности ее разведения, рецепты и
приготовление питательной среды для мушек, ознакомиться с
имеющимися линиями мухи, научиться отличать самок и самцов в каждой
линии.
Методические указания. С 1907 года дрозофила - один из основных
подопытных организмов для генетики. Это "главная" муха генетиков.
Описал главный объект генетики немецкий натуралист, энтомолог,
специалист по Двукрылым насекомым Иоганн Вильгельм Майген. По-
видимому, первым, кто начал разводить дрозофил в лабораторных
условиях, был энтомолог Ч. Вудворт (С. W. Woodworth). Впервые
дрозофил для генетических экспериментов использовал генетик Касл (W.
Е. Castle), однако, широко это насекомое стало использоваться в научных
исследованиях с 1909 г. с легкой руки Томаса Ханта Моргана. Все свои
исследования Морган и его ученики провели на Drosophila melanogaster,
изучали в основном самопроизвольно возникающие мутации. Первую
мутацию (мух с белыми глазами) Морган обнаружил в 1910 году.
В СССР дрозофила привезена из лаборатории Т. Моргана его
учеником Германом Джозефом Мёллером в 1922 г. Он посетил Институт
экспериментальной биологии, созданный Н.К. Кольцовым, и привез с
собой небольшую коллекцию мутантов дрозофилы (около 20 мутантных
линий).
Drosophila melanogaster, иначе плодовая, или дрозофила фруктовая
или уксусная муха, или дрозофила малая, или дрозофила чернобрюхая
дрозофила обыкновенная - маленькое, около 3 мм в длину, насекомое
семейства Drosophiliadae (плодовые мушки) из отряда Diptera (двукрылые
насекомые).
Латинское название семейства произошло от названия рода
Drosophila («любящий влагу, росу»), впервые описанного С.Ф.Фалленом в
1823 г.
Научная классификация:
Домен: Eukaryota (Эукариоты)
Царство: Animalia (Животные)
Тип: Arthropoda (Членистоногие)
Класс: Insesta (Насекомые)
Отряд: Diptera (Двукрылые)
Семейство: Drosophilidae (Плодовые мушки)
Род: Drosophila (Дрозофилы)
Вид: Drosophila melanogaster (Дрозофила фруктовая)
4
Насекомое причислили к роду Drosophila морфологически, тогда как
современные генетические исследования относят её к роду Sophophora
этого семейства.
К настоящему времени описано около 1500 видов Drosophila, в
Европейской части России встречаются около 40 видов этого рода.
Плодовые мухи распространены очень широко, по всем
географическим зонам. Большинство видов Drosophila обитают в
тропических и субтропических зонах, там, где тепло и много фруктов.
В России дрозофила обитает в южных регионах, эта муха обычна на
виноградниках и в фруктовых садах. На севере этот вид встречается до 60°
северной широты, куда он попадает в летнее время вместе с привозимыми
фруктами и овощами из южных районов.
Дрозофила фруктовая – синантропный вид, т.е. не встречается вне
поселений человека. Места обитания – винные и фруктовые хранилища,
овощные магазины, жилые помещения. Очень чувствительна к запахам
забродивших фруктов. Питаются взрослые особи нектаром цветков,
растительными соками (березы, сосны, дуба) и гниющими органическими
веществами фруктов, овощей, пивным суслом, вином и др.
Дрозофилы не относятся к числу хорошо летающих насекомых и за
день пролетают не более 180 м.
Дрозофилы являются типичными представителями отряда
двукрылых насекомых (рис.1). Окрас тела желтый, коричневатый или
бурый, в редких случаях черный. Брюшко имеет темные полоски.

Рис. 1. Морфологическое строение дрозофилы:
1 - голова, 2 - грудь, 3 - брюшко, 3а - сегменты брюшка,
4 - ноги, 5 - крыло, 6 - фасеточный глаз

Голова шаровидная, очень подвижная. Сложные фасеточные глаза
хорошо развиты и занимают большую часть боковой поверхности головы.
В большинстве случаев, глаза красного или бурого цвета. В верхней части
лба имеется так же 3 простых глазка.
Ротовой аппарат лижущего типа, внешне выглядит в виде хоботка.
Грудь из 3 сегментов. Хорошо развита среднегрудь и часто покрыта
крупными щетинками.
Брюшко состоит из 4-5 видимых сегментов.
5
Передняя пара крыльев плодовых мушек хорошо развита. Задняя
пара крыльев преобразована в жужжальца – орган-балансир. Крылья
прозрачные.
Внутреннее строение. Пищеварительная система. В брюшке
расположена бóльшая часть пищеварительной системы, главным образом
кишечник. В передней части брюшка располагается зоб – тонкостенный
мешок, соединенный узкой трубкой с пищеводом.
Органами выделения служат мальпигиевы сосуды – длинные тонкие
трубочки, открывающиеся в кишечник.
Кровеносная и дыхательная системы. Жидкой средой организма
является гемолимфа, являющаяся аналогом крови в кровеносной системе
высших животных. Система кровообращения незамкнутая, гемолимфа
свободно омывает внутренние органы и полости тела, затем собирается в
сосуды. Функцию сердца выполняет утолщенный спинной сосуд в задней
части груди. Дыхательная система – трахеи, газообмен осуществляется в
брюшке, где расположено множество трахей рядом с аортой. Характерно
наличие головного мозга.
Половая система. Наружные половые органы - копулятивные
органы у самцов и яйцеклад у самок. Внутренние половые органы,
расположенные в брюшке, состоят из гонад (семенники у самцов и
яичники у самок), придаточных желез, секретирующих жидкий секрет, и
выводных протоков.
Широкое использование дрозофилы в генетических исследованиях и
в учебных целях определяется следующим:
1) короткий цикл развития (10 – 14 дней при температуре 24 – 25
0С); Размножение половое. Развитие круглогодичное. D. melanogaster
относится к насекомым с полным превращением, т. е. в своем развитии она
проходит стадии яйца, личинки, куколки и имаго (Рис.2). После
откладки яиц самкой через 1-2 дня из яйца вылупляется личинка.
Стадия личинки длится 4-5 суток, куколки – 4-5 суток в зависимости
от температуры.
Личинки развиваются в разлагающихся субстратах: фруктах, овощах,
грибах, гниющих растениях. В них в больших количествах развиваются
бактерии и дрожжи, которые служат основной пищей личинкам мух.
Личинка линяет три раза и после третьей линьки превращается в
куколку. Непрямое развитие дрозофилы завершается вылетом мухи,
которая на вторые сутки после вылупления становится половозрелой.
Продолжительность жизни взрослой мухи с момента вылупления ее
из куколки в среднем составляет 3-4 недели (max до 5 мес.), но в
значительной степени зависит от условий обитания.

6
Яйцо D. Melanogaster
Личинка
D. melanogaster

Рис. 2. Жизненный цикл дрозофилы

2) высокая плодовитость (от 200-400 до 1500 и более яиц от одной
самки за период жизни в зависимости от условий обитания или до 60-80
яиц за одну кладку). Откладка яиц начинается через 1-3 дня после выхода
из куколки. Яйца самки откладывают в течение всей жизни. Плодовитость
достигает максимума у 4-6-дневных мух.
3) малое количество хромосом. Кариотип дрозофилы включает
четыре пары хромосом (2n=8): первая пара - X/Y - половые хромосомы и
аутосомы 2, 3 и 4 пары. Четвёртая пара хромосом мелкая, точковидная; X
(или первая), 2 и 3-я хромосомы – метацентрические (Рис 3). Это первый
биологический объект, для которого были составлены генетические карты,
т.е. известно место каждого гена в хромосоме. Геном состоит из примерно
132 миллионов оснований и содержит приблизительно 14000 (13 767)
генов (для сравнения, геном человека имеет 3.300 миллионов оснований и
около 70.000 генов). В настоящее время геном дрозофилы полностью
описан (секвенирован и аннотирован).

Рис. 3. Хромосомы самки и самца дрозофилы

7
4) многообразие естественных популяций и мутантных линий
(более 170 линий). В результате большого числа генетических мутаций
получены мухи с различными морфологическим признаками (Рис. 4 и 5):
окраска тела (желтая, черная, белая, темная), окраска глаз (темно-красная,
ярко-красная, коричневая, белая), форма крыльев (различным образом
изогнутые, зачаточные), различные аномальные формы щетинок,
жилкования крыльев и множество других признаков, которые сильно
отличают их от «диких» особей. Дикая плодовая муха в природной среде
имеет светлое тело, длинное крыло и ярко-красные глаза.
В приложении 1 приведена характеристика некоторых наиболее
распространенных мутантных линий дрозофилы меланогастер.

Рис 4. Мутантные линии дрозофилы по строению крыльев:
А – с зазубренными крыльями; Б - с недоразвитыми крыльями;
В - с загнутыми крыльями (вид спереди и сбоку); Г – бескрылые

Рис. 5. Мутации окраски и формы глаз у дрозофилы:
1 - дикий тип - тускло-красные глаза;
мутантные формы: 2 - розовые глаза, 3 - белые глаза,
4 - уменьшенные, «полосковидные»

5) возможность развития на искусственных агаросодержащих
средах.
Дрозофила хорошо размножается в лабораторных условиях на
искусственных питательных средах. Для ее разведения используют
плоскодонные флаконы (пробирки или бутылочки из светлого стекла)
объемом 30-50 мл. Для питания дрозофилы разработаны разные
питательные среды, основными компонентами которых являются сахар,
8
дрожжи, манная крупа, вода и агар-агар. В состав питательной среды могут
добавляться другие компоненты: изюм, бананы.
В таблице 1 приводится один из наиболее простых, доступных,
распространённых и хорошо себя зарекомендовавших рецептов
питательной среды для дрозофилы, используемых для лабораторного
практикума в вузах, в том числе и в Вологодской ГМХА.

Таблица 1 - Состав питательной среды для дрозофилы (в расчёте на
определённое количество пробирок)

Количество Агар-
Прессованные Сахарный Манная
пробирок, Вода, мл агар,
дрожжи, г песок, г крупа, г
шт. г
50 350 4,5 40 13 13
100 700 9,0 75 25 25
150 1050 15,0 115 40 40
200 400 18,0 150 50 50
300 2100 27,0 225 75 75
400 2800 3,0 300 100 100
500 3500 45,0 375 125 125

Все манипуляции с мушками выполняют под наркозом. Для этих це-
лей применяют медицинский эфир для наркоза. Наркоз мух проводят в су-
хих чистых бутылочках с крышкой, внутрь которой помещается ватный
тампончик, смоченный эфиром (эфиризатор или морилка). Осторожным
встряхиванием или постукиванием пальцами о стенки бутылочки следует
перегнать мух из бутылочки с питательной средой в морилку. Как только
мухи перестанут двигаться, их нужно тотчас вытряхнуть на чистый лист
бумаги. От большей дозы наркоза мухи погибают через 3-5 мин.
У половозрелых плодовых мух наблюдается хорошо выраженный
половой диморфизм (Рис. 6):
- самки крупнее (до 3 мм и более), имеют округлое брюшко с
заостренным кончиком и пятью хорошо различимыми темными
полосками.
- самцы мельче, брюшко цилиндрическое с двумя полосками,
последние брюшные сегменты слиты, благодаря чему кончик брюшка
темный (почти черный).
Однако следует учитывать, что величина самок и самцов может
сильно колебаться в зависимости от условий питания и численности
популяции во флаконе.

9
Рис. 6. Половой диморфизм у дрозофилы

Все отмеченное выше делает дрозофилу удобным лабораторным
объектом для занятий по гибридологическому анализу.

Лабораторная работа № 1. Биология, морфология и разведение
дрозофилы. Сравнительная характеристика линий Drosophila
melanogaster

Материал и оборудование. Бутылочки с разными линиями дрозофи-
лы, лупы, пинцеты, эфиризаторы (морилки), капельница с эфиром для нар-
коза.
Выполнение работы: 1. Поместите мушек в эфиризатор (морилку) и
усыпите с помощью эфира. Найдите все части тела дрозофилы: голову,
грудь, брюшко, конечности, крылья.
2. Рассмотрите последовательно все линии дрозофилы (см. приложе-
ние). Определите мутантные формы. Какие части тела мутантных форм
подвержены мутации (отсутствуют крылья, изменена окраска туловища,
цвет глаз)?
3. Распределите мушек по полу на самок и самцов. В чем различия
между самками и самцами одной линии?
Результаты исследований занесите в таблицу 2, сделайте вывод.
Контрольные вопросы
1. Назовите биологические особенности плодовой мушки.
2. Каково морфологическое строение тела дрозофилы?
3. В чем особенности развития дрозофилы?
4. Какие компоненты входят в состав питательной среды для
разведения дрозофилы?
5. Как приготовить питательную среду?
6. В чем заключается половой диморфизм женских и мужских
особей дрозофилы?
10