Dokumentvorlage für wissenschaftliche Arbeiten

202 Pages·2016·4.46 MB·German

by  Riebel, Matthias

Quantitative Proteomanalytik von Riesling- und
Dornfelder-Trauben sowie der Einfluss von
traubeneigener Tyrosinase auf gesundheits-

fördernde Inhaltsstoffe des Weins

Dissertation zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften

Am Fachbereich Biologie
der Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Matthias Riebel
geb. am 18.04.1982 in Mainz

Mainz, 2016

Dekan:
1. Berichterstatter:
2. Berichterstatter:
Tag der mündlichen Prüfung:
Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................. I
Zusammenfassung .......................................................................................... VI
Abstract ........................................................................................................... VII
1 Einleitung.................................................................................................. 1
1.1 Trauben und Wein ............................................................................... 1
1.1.1 Traubenwachstum .................................................................. 2
1.1.2 Proteine in Traube und Wein .................................................. 3
1.2 Phenolische Weininhaltsstoffe ............................................................. 6
1.2.1 Einfluss von phenolischen Weininhaltsstoffen auf
…….....Eigenschaften des Weins ........................................................ 6
1.2.2 Klassifizierung von phenolischen Weininhaltsstoffen .............. 7
1.2.2.1 Flavonoide ................................................................ 7
1.2.2.2 Phenolsäuren ........................................................... 9
1.2.2.3 Stilbene .................................................................. 10
1.2.3 Oxidativer Stress und die daraus resultierenden
……..…Krankheiten ........................................................................... 12
1.2.4 Antioxidative Wirkung von phenolischen
………..Weininhaltsstoffen................................................................. 13
1.3 Tyrosinase ......................................................................................... 15
1.3.1 Reaktionen und Mechanismen der Tyrosinase ..................... 16
1.3.2 Aufbau der Tyrosinase aus Trauben ..................................... 17
1.3.3 Most- und Weinoxidation ...................................................... 18
1.4 Ziele dieser Arbeit .............................................................................. 19
2 Material und Methode ............................................................................ 20
2.1 Geräte und Hilfsmittel ........................................................................ 20
2.2 Chemikalien ....................................................................................... 23
2.3 Proteinbiochemische Arbeiten ........................................................... 26
2.3.1 Puffer und Lösungen ............................................................. 26
2.3.2 Gewinnung des Probenmaterials .......................................... 34
2.3.3 Proteinfällungsmethoden ...................................................... 35
2.3.3.1 Acetonfällung ......................................................... 35
2.3.3.2 Phenolfällung ......................................................... 36
2.3.3.3 Proteinfällung mit „ProteoExtract Protein Precipi-
….....tation Kit“ von Calbiochem (Calbiochem-Fällung) .. 36
2.3.3.4 Trichloressigsäurefällung (TCA-Fällung) ................ 36
2.3.3.5 Fällung nach Martinez ............................................ 37
2.3.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ............................ 37
2.3.5 SDS-PAGE ........................................................................... 38

I
Inhaltsverzeichnis

2.3.6 Native PAGE ......................................................................... 39
2.3.7 Zweidimensionale SDS-PAGE (2D-SDS) ............................. 39
2.3.8 Coomassie-Färbung ............................................................. 41
2.3.9 Silberfärbung......................................................................... 41
2.3.10 Aufreinigung von Tyrosinase aus Rieslingtrauben ................ 42
2.3.10.1 Gewinnung des Probenmaterials ........................... 42
2.3.10.2 Größenausschluss-Chromatographie (SEC) .......... 42
2.3.10.3 Dot Blot .................................................................. 42
2.3.10.4 Konzentration von Tyrosinase ................................ 43
2.3.11 Bradford-Test ........................................................................ 43
2.3.12 Konzentrationsbestimmung durch Absorptionsmessung
………..bei 280 nm ............................................................................ 43
2.3.13 Western Blot (WB) ................................................................ 44
2.3.14 Dünnschichtchromatographie (DC) ....................................... 45
2.3.15 Dialyse .................................................................................. 45
2.3.16 Lyophilisation ........................................................................ 46
2.3.17 Massenspektrometrie ............................................................ 46
2.3.18 Proteom-Annotierung ............................................................ 46
2.4 Spektroskopie .................................................................................... 47
2.4.1 Absorptions-Spektroskopie ................................................... 47
2.4.2 Bestimmung der Tyrosinase-Aktivität .................................... 47
2.4.2.1 MBTH-Assay .......................................................... 47
2.4.2.2 O2-Verbrauchsmessung ......................................... 48
2.4.3 Produktkinetiken ................................................................... 48
2.4.4 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH) Test .......................... 48
2.5 Zellkultur ............................................................................................ 50
2.5.1 L-012-Assay .......................................................................... 50
3 Ergebnisse.............................................................................................. 52
3.1 Fällung von Traubenproteinen ........................................................... 52
3.2 Annotation isolierter und identifizierter Trauben-proteine .................. 53
3.3 Zweidimensionale SDS-PAGE von Traubenproteinen ...................... 60
3.4 Entwicklung des Proteoms von Rieslingtrauben des Jahrgangs
2012 während der Reifung ................................................................ 61
3.4.1 Lipid Transfer Protein ............................................................ 65
3.4.2 Tyrosinasen .......................................................................... 66
3.4.3 Chitinasen und TLPs ............................................................. 67
3.4.4 Invertase ............................................................................... 67
3.5 Vergleich der Entwicklung des Proteoms der Reifestadien von
Rieslingtrauben der Jahrgänge 2012 und 2013 ................................. 68
3.5.1 Wetteranalysen der Jahre 2012 und 2013 ............................ 69
3.6 Entwicklung des Proteoms von Dornfeldertrauben des Jahrgangs
2012 während der Reifung ................................................................ 72

II
Inhaltsverzeichnis

3.6.1 Probenakquise ...................................................................... 72
3.6.2 Vergleich der Proteinzusammensetzung von Dornfelder-
…..……trauben während der Reifung nach Calbiochem- und
…..……Phenolfällung ........................................................................ 73
3.6.3 2D-Gelelektrophoresen der Grün- und Reifestadien von
…….…Dornfeldertrauben des Jahrgangs 2012................................. 76
3.6.3.1 Tyrosinasen ............................................................ 78
3.6.3.2 Chitinasen .............................................................. 80
3.6.3.3 TLPs ....................................................................... 80
3.7 Zusammenfassung der Untersuchungen des Traubenproteoms ....... 80
3.8 Isolierung und Aufreinigung traubeneigener Tyrosinasen ................. 82
3.9 Umsatz phenolischer Weininhaltsstoffe durch Tyrosinase ................ 85
3.9.1 Umsatz von Hydroxyzimtsäuren durch Tyrosinase aus
…..……Rieslingtrauben ..................................................................... 86
3.9.1.1 Kaffee- und Kaftarsäure ......................................... 86
3.9.1.2 p-Cumarsäure ........................................................ 87
3.9.1.3 Ferula- und Sinapinsäure ....................................... 87
3.9.2 Umsatz von trans-Stilbenen durch Tyrosinase aus
…..……Rieslingtrauben ..................................................................... 88
3.9.3 Umsatz von Chalkonen durch Tyrosinase aus
…..……Rieslingtrauben ..................................................................... 89
3.9.4 Umsatz von Hydroxybenzoesäuren durch Tyrosinase aus
……..…Rieslingtrauben ..................................................................... 90
3.9.4.1 Gallussäure und Ethylgallat .................................... 90
3.9.4.2 4-Hydroxybenzoesäure und 3,4-Dihydroxy-
……benzoesäure ............................................................ 91
3.9.4.3 Vanillinsäure ........................................................... 92
3.9.4.4 Vergleich des Umsatzes von phenolischen
…....Weininhaltsstoffen durch Tyrosinase aus
….…Rieslingtrauben ...................................................... 93
3.9.5 Sauerstoffverbrauchsmessungen mit Tyrosinase aus
…..……Agaricus bisporus ................................................................. 94
3.10 Bestimmung des Temperaturoptimums der Rieslingtyrosinase ....... 96
3.11 Einfluss von Wein und Tyrosinase auf die antioxidative
…Kapazität von Zellkulturen .............................................................. 99
3.12 Einfluss von Tyrosinase aus Agaricus bisporus auf die
….antioxidative Wirkung von phenolischen Weininhaltsstoffen ....... 102
3.12.1 Kaffeesäure......................................................................... 104
3.12.2 Gallussäure ......................................................................... 106
3.12.3 Ferulasäure ......................................................................... 106
3.12.4 Resveratrol und Polydatin ................................................... 108
3.12.5 p-Cumarsäure ..................................................................... 108
3.12.6 Phlorizin .............................................................................. 109

III
Inhaltsverzeichnis

3.12.7 Zusammenfassende Betrachtung der Versuche zum
…….....Einfluss von Tyrosinase aus Agaricus bisporus auf die
…..…...antioxidative Wirkung von phenolischen Weininhaltsstoffen 110
3.13 Einfluss von Tyrosinase aus Rieslingtrauben auf die
..antioxidative Wirkung von phenolischen Weininhaltsstoffen.......... 112
3.13.1 Hydroxyzimtsäuren ............................................................. 113
3.13.2 Hydroxybenzoesäuren ........................................................ 116
3.13.3 Chalkone ............................................................................. 117
3.13.4 Stilbene ............................................................................... 118
3.13.5 Zusammenfassende Betrachtung der Versuche zum
………..Einfluss von Tyrosinase aus Agaricus bisporus und
………..Rieslingtrauben auf die antioxidative Wirkung von
………..phenolischen Weininhaltsstoffen ........................................ 118
3.14 Verlauf der Tyrosinaseaktivität während der Weinbereitung von
…Riesling ........................................................................................ 120
3.14.1. Einfluss von Schwefel (Kaliumdisulfit) auf die
………..Tyrosinaseaktivität .............................................................. 124
3.14.1. Einfluss von Bentonit auf die Tyrosinaseaktivität ................ 125
4 Diskussion ............................................................................................ 127
4.1 Proteinextraktion aus pflanzlichem Gewebe .................................... 127
4.2 Proteom reifer Trauben ................................................................... 128
4.3 Entwicklung des Proteoms von Trauben während der Reifung ....... 130
4.3.1 Verlauf der Expression von PR-Proteinen während der
………..Traubenreifung ................................................................... 130
4.4 Isolierung und Aufreinigung von Tyrosinase aus Trauben ............... 131
4.5 Temperaturabhängigkeit der Tyrosinase aus Trauben .................... 133
4.6 Antioxidative Kapazität von Wein sowie dessen phenolische
Inhaltsstoffe ..................................................................................... 135
4.6.1 Bioverfügbarkeit von Phenolen sowie deren
………..Tyrosinaseoxidationsprodukte ............................................ 137
4.6.1.1 Antioxidative Wirkung von Phenolen im Darm ..... 141
4.6.2 Einfluss von Laccase auf die antioxidative Kapazität von
………..Wein, sowie phenolischer Weininhaltsstoffe ....................... 142
4.6.3 Abschließende Betrachtung des Einflusses von
………..Tyrosinase auf die antioxidative Kapazität von Wein sowie
………..phenolischer Weininhaltsstoffe ........................................... 143
6 Literatur ................................................................................................ 145
7 Verzeichnisse ....................................................................................... 167
7.1 Abkürzungsverzeichnis .................................................................... 167
7.2 Abbildungsverzeichnis ..................................................................... 168
7.3 Tabellenverzeichnis ......................................................................... 171

IV
Inhaltsverzeichnis

8 Anhang ................................................................................................. 172
9 Veröffentlichungen .............................................................................. 189
10 Danksagung ......................................................................................... 190
11 Lebenslauf ............................................................................................ 191
12 Erklärung .............................................................................................. 192

V
Zusammenfassung

Zusammenfassung
Die Proteinzusammensetzung von Trauben hat einen großen Einfluss auf ver-
schiedene Eigenschaften der aus ihnen produzierten Weine. Hierbei sind im
Besonderen „Pathogenesis-Related“ (PR) Proteine von Bedeutung. Sie sind an
der unerwünschten Trübung bei der Lagerung von Weißweinen beteiligt, kön-
nen zur exzessiven Bräunung von Mosten beitragen, haben indirekten Einfluss
auf die Haltbarkeit der Weine oder weisen allergenes Potential auf. In der vor-
liegenden Arbeit wurde die Proteinzusammensetzung reifer Dornfeldertrauben
in einem bisher unerreichten Detailgrad bestimmt. Insgesamt konnten 712 Pro-
teine identifiziert und quantifiziert werden. Die meisten dieser Proteine sind an
„stress response“ Reaktionen und metabolischen Prozessen der Traube betei-
ligt. Während alle Schlüsselenzyme der Glykolyse gefunden wurden, konnten
zwei Schlüsselenzyme der Glukoneogenese nicht nachgewiesen werden. Dies
lässt die Vermutung zu, dass die Glykolyse in reifen Trauben aktiver ist als die
Glukoneogense, was im Kontrast zu den bisherigen Erkenntnissen steht.
Tyrosinasen sind kupferhaltige Enzyme, die phenolische Substanzen zu o-
Chinonen oxidieren. Während der Weinherstellung können sie so zur uner-
wünschten Bräunung von Mosten beitragen. Tyrosinasen sind in der Traube
selbst unter anderem an der Pathogenabwehr beteiligt. In der vorliegenden Ar-
beit wurde zum ersten Mal der Einfluss von Tyrosinase auf phenolische Inhalts-
stoffe des Weins in Bezug auf ihre gesundheitsfördernde Wirkung untersucht.
Hierbei wurde sowohl die Scavenger-Aktivität der Phenole als auch deren Ein-
fluss auf den Oxidationszustand von menschlichen Zelllinien vor und nach Oxi-
dation durch Tyrosinase untersucht. Es stellte sich heraus, dass ein Umsatz
durch Tyrosinase das antioxidative Potential bei einigen phenolischen Weinin-
haltsstoffen, wie z.B. Resveratrol, noch weiter erhöhen kann. Es konnte weiter-
hin gezeigt werden, dass während der Weinherstellung Tyrosinase bis zur Gä-
rung aktiv sein kann und sie somit ihre positive Wirkung auf die gesundheitsför-
dernde Wirkung von Wein entfalten kann.

VI
Abstract

Abstract
The protein composition of grapes has a great influence on various characteris-
tics of the wines produced from them. Here, in particular, "pathogenesis-related"
(PR) proteins are important. They are involved in the undesirable haze for-
mation during the storage of white wines, may contribute to excessive browning
of musts, have indirect influence on the durability of wine or have allergenic po-
tential. In this study the protein composition of mature Dornfelder grapes was
determined in an unprecedented level of detail. A total of 712 proteins were
identified and quantified. Most of these proteins are involved in stress response
reactions and metabolic processes of the grape. While all key enzymes of gly-
colysis were found, two key enzymes of gluconeogenesis could not be detect-
ed. This leads to the assumption that glycolysis is more active in ripe grapes
than the gluconeogenesis what is in contrast to the previous findings.

Tyrosinases are copper-containing enzymes which oxidize phenolic substances
to o-quinones. During the winemaking process, they can thus contribute to the
undesired browning of musts. In the present work, the influence of tyrosinase on
the health-promoting phenolic wine components was investigated.
Both the scavenger activity of the phenols, as well as their influence on the oxi-
dation state of human cell lines before and after oxidation by tyrosinase was
investigated. The results of this work revealed that an oxidation through tyrosi-
nase can further increase the antioxidant potential of some phenolic wine com-
ponents such as Resveratrol. It has also been shown that during winemaking
tyrosinase can be active until the fermentation and thus can unfold their positive
effect on the health benefits of wine.

VII