dna dizi analizi ile belirlenmesi

105 Pages·2013·1.38 MB·Turkish

T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİMDALI

ALFA TALASEMİ MUTASYONLARININ
DNA DİZİ ANALİZİ İLE BELİRLENMESİ

Figen GÜZELGÜL

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI
Prof. Dr. Kıymet AKSOY

ADANA-2010
T.C.
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİMDALI

ALFA TALASEMİ MUTASYONLARININ
DNA DİZİ ANALİZİ İLE BELİRLENMESİ

Figen GÜZELGÜL

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI
Prof. Dr. Kıymet AKSOY

Bu tez, Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından
TF2009YL17 nolu proje olarak desteklenmiştir.
Tez No.................

ADANA-2010

ii

TEŞEKKÜR

Çalışmam sırasında bilimsel katkıları ile bana yardımcı olan, eğitimim süresince
büyük özveri ve sabrıyla yardımlarını esirgemeyen, saygıdeğer tez danışmanım Prof.Dr.
Kıymet AKSOY’a çok teşekkür ederim.
Ders aşamasında teorik bilgilerini aktaran, pratik alandaki uygulamalar ımda
yardımlarını esirgemeyen Prof.Dr. Nurten Dikmen’e, Prof.Dr. Levent Kayr ın’a, Prof.Dr.
Akif Çürük’e ve Prof.Dr. Abdullah Tuli’ye teşekkür ederim.

Yüksek lisans öğrenimim sürecinde desteklerini ve tecrübelerini payla şan Dr.
Erdinç Yal ın’a, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dal ı Asistanlar ına, teknik ve di ğer
personellere de teşekkür ederim.

Öğrenim hayatım boyunca sabırlarından ve desteklerinden dolay ı tüm aileme
çok teşekkür ederim.
Tez çalışmamı TF2009YL17 nolu proje ile maddi olarak destekleyen Çukurova
Üniversitesi Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.

iii
İÇİNDEKİLER

KABUL ve ONAY............................................................................................................ii
TEŞEKKÜR.....................................................................................................................iii
İÇİNDEKİLER ................................................................................................................iv
ŞEKİLLER DİZİNİ.........................................................................................................vii
ÇİZELGELER DİZİNİ.....................................................................................................ix
SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ.......................................................................x
ÖZET...............................................................................................................................xii
ABSTRACT...................................................................................................................xiii
1.GİRİŞ ve AMAÇ............................................................................................................1
2.GENEL BİLGİLER........................................................................................................3
2.1. Hemoglobin Molekülünün Tarihçesi......................................................................3
2.2. Hemoglobin Molekülünün Yapısı..........................................................................3
2.2.1.Hem’in Yap ısı...............................................................................................5
2.2.2.Globin Zincir Gen Yap ısı.............................................................................7
2.2.2.1. α-Benzer Globin Gen Kümesi...................................................................7
2.2.2.2. β-Benzer Globin Gen Kümesi...................................................................9
2.3.Hemoglobin Molekülünün Kalıtsal Bozuklukları.................................................10
2.3.1.Anormal Hemoglobinler.............................................................................11
2.3.2.Talasemiler..................................................................................................13
2.3.2.1. β-Talasemi...............................................................................................13
2.3.2.2. α-Talasemi...............................................................................................14
2.3.2.2.1.Delesyonel α-Talasemiler.....................................................................15
2.3.2.2.1.1. α0-Talasemiler....................................................................................15
2.3.2.2.1.2. α+-Talasemiler....................................................................................17
2.3.2.2.2. Delesyonel Olmayan (Nondelesyonel ) α-Talasemiler........................19
2.3.2.2.2.1.RNA “Splincing”i Etkileyen Mutasyonlar........................................20
2.3.2.2.2.2.Poli A Kuyru ğu Sinyalini Etkileyen Mutasyonlar.............................20
2.3.2.2.2.3.mRNA Translasyonunun Ba şlamasını Etkileyen Mutasyonlar.........21
iv
2.3.2.2.2.4.Frameshift Delesyonlar ı ....................................................................22
2.3.2.2.2.5.Zincir Sonlanma Mutasyonlar ı..........................................................23
2.3.2.2.3. α-Talasemilerin Klinik Tablosu............................................................25
2.3.2.2.3.1.Sessiz Ta şıyıcı....................................................................................26
2.3.2.2.3.2.Hemoglobin Trait...............................................................................26
2.3.2.2.3.3. Hemoglobin H...................................................................................27
2.3.2.2.3.4.Hemoglobin Bart’s.............................................................................28
2.3.2.2.4. α-Talasemilerin Coğrafik Dağılımı ve İnsidansı.................................30
2.3.2.2.4.1.Dünyada α-Talasemi İnsidansı..........................................................30
2.3.2.2.4.2.Türkiye’de α-Talasemi İnsidansı.......................................................31
2.3.2.2.4.3.Çukurova’da α-Talasemi İnsidansı....................................................32
3.GEREÇ VE YÖNTEM.................................................................................................33
3.1.Gereçler..........................................................................................................33
3.1.1.Cihazlar.......................................................................................................33
3.1.2.Kimyasal Malzemeler.................................................................................34
3.2.Örnek Seçimi.................................................................................................35
3.3.Yöntemler......................................................................................................35
3.3.1.Hematolojik Çalışmalar..............................................................................35
3.3.2. Hemoglobin Elektroforezi.........................................................................35
3.3.3.Mikrokolon Kromatografisi ile Hb A Ölçümü..........................................37
2
3.3.4. Modifiye Betke Yöntemi ile Fetal Hemoglobin (Hb F) Ölçümü...............38
3.3.5.Oraklaşma Testi..........................................................................................39
3.3.6.Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC)...........................................39
3.3.7.Tam Kandan DNA İzolasyonu...................................................................41
3.3.8.ARMS Yöntemi ile Mutasyonların Belirlenmesi.......................................43
3.3.8.1. Agaroz Jel Elektroforezi.........................................................................46
3.3.9. Gap PCR Yöntemi ile α-Talasemi Mutasyon Taraması............................46
3.3.9.1. .Agaroz Jel Elektroforezi........................................................................48
3.3.10. DNA Dizi Analizi....................................................................................49
3.3.10.1.Hedef DNA’nın Çoğaltılması ve İşaretlenmesi.....................................49
3.3.10.1.1. Hedef DNA’nın Çoğaltılması............................................................51
3.3.10.1.1.1. Agaroz Jel Elektroforezi.................................................................52
v
3.3.10.1.2. Çoğaltılmış DNA’nın İşaretlenmesi..................................................53
3.3.10.1.3. Pürifikasyon.......................................................................................54
3.3.10.2.DNA Dizi Analizi Cihazına Örnek Yüklenmesi....................................54
3.3.10.2.1.Örneklerin Cihaza Yüklenmesi...........................................................56
3.3.10.2.2.Verilerin Değerlendirilmesi................................................................57
4.BULGULAR................................................................................................................58
5.TARTIŞMA..................................................................................................................71
6.SONUÇLAR VE ÖNERİLER.....................................................................................79
7.KAYNAKLAR.............................................................................................................80
EK-1: Etik Kurul Onay Formu........................................................................................89
EK-2: Denek Bilgilendirme ve Rıza Olur Formu............................................................90
ÖZGEÇMİŞ....................................................................................................................91

vi
ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1.Hemoglobin molekülünün yapısı.......................................................................4
Şekil 2.2.Embriyonik ve fetal gelişimin farklı evrelerinde globin zincir sentezi..............5
Şekil 2.3.Hem’in yapısı.....................................................................................................6
Şekil 2.4. Hem halkasının oksijene ve histidine bağlanması...........................................6
Şekil 2.5. Alfa benzer globin gen kümesi.........................................................................8
Şekil 2.6. Alfa benzer globin gen kümesinin sentezini düzenleyen hipersensitif
bölgeler..............................................................................................................................8
Şekil 2.7. Beta benzer globin gen kümesi.........................................................................9
Şekil 2.8. Beta benzer globin gen kümesinin sentezini düzenleyen hipersensitif
bölgeler.............................................................................................................................9
Şekil 2.9. Hemoglobin varyantlarının ve talasemilerin dünya üzerindeki yayılımı.......11
Şekil 2.10. α0 Talasemilere neden olan delesyonel mutasyonların büyüklükleri...........16
Şekil 2.11. α+ Talasemiye neden olan çaprazlamalar......................................................18
Şekil 2.12. α+ Talasemilere neden olan delesyonel mutasyonların büyüklükleri..........19
Şekil 2.13. A) Hemoglobin “trait”li bir hastanın periferik yayması B) Bazı hemoglobin
“trait”li hastalarda görülebilecek inklüzyon cisimcikli hücre.........................................27
Şekil 2.14. Alfa talasemilerde α/β globin zincirlerinin biyosentezlerinin oranları........29
Şekil 2.15. Dünyada alfa talasemi insidansı....................................................................31
Şekil 3.1. α globin geni primerlerinin çoğaltım yöreleri................................................50
1
Şekil 3.2. α globin geni primerlerinin çoğaltım yöreleri................................................51
2
Şekil 3.3. Lazer destekli kapiller elektroforezin şematik görünümü..............................55
Şekil 3.4. DNA bazlarının farklı dalga boylarında farklı renkler ile görüntülenmesi..56
Şekil 4.1. NBY (4y) olgusunun (Y ailesinin) soy ağacı.................................................60
Şekil 4.2. Homozigot 5 nt’lik delesyon gözlenen NBY (4y) olgusunun DNA Dizi
Analizi görüntüsü...........................................................................................................61
Şekil 4.3. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen AY (30y) olgusunun DNA Dizi
Analizi görüntüsü...........................................................................................................62
vii
Şekil 4.4. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen YY (33y) olgusunun DNA Dizi
Analizi görüntüsü............................................................................................................62
Şekil 4.5. Heterozigot 5nt’lik delesyon gözlenen AY (9y) olgusunun DNA Dizi Analizi
görüntüsü.........................................................................................................................62
Şekil 4.6. Gap- PCR yöntemi ile 20.5 kb’l ık alfa talasemi mutasyonu gözlenen HY(4y)
olgusunun agaroz jel elektroforez görüntüsü...................................................................63
Şekil 4.7. ŞB (35y) olgusunun (B ailesinin) soy ağacı....................................................64
Şekil 4.8. ŞB (35y) ve ŞY (63y) olgular ının selüloz asetat ka ğıt elektroforez
görüntüsü.........................................................................................................................65
Şekil 4.9. ŞB (35y) olgusunun HPLC verileri................................................................66
Şekil 4.10. ŞY (63y) olgusunun HPLC verileri...............................................................67
Şekil 4.11. Hb Stanleyville II (Hb St II) mutasyonu gözlenen ŞB (35 y) olgusunun
DNA Dizi Analizi görüntüsü.........................................................................................68
Şekil 4.12. Hb Stanleyville II (Hb St II) mutasyonu gözlenen ŞY (63 y) olgusunun
DNA Dizi Analizi görüntüsü..........................................................................................68
Şekil 4.13. Gap- PCR yöntemi ile 3,7kb’lık alfa talasemi mutasyonu gözlenen olguların
agaroz jel elektroforez görüntüsü...................................................................................69
Şekil 4.14. ARMS yöntemi ile β IVS-I-110 mutasyonunun agaroz jel elektroforez
görüntüsü.........................................................................................................................70

viii
ÇİZELGELER DİZİNİ

Tablo 2.1. Embriyonik, fetal ve erişkin dönemde sentezlenen insan hemoglobinleri......4
Tablo 2.2. Hemoglobin molekülünün kalıtsal bozukluklarının sınıflandırılması..........10
Tablo 2.3. Türkiye’de belirlenen alfa globin zincirinden kaynakl ı anormal
hemoglobinler..................................................................................................................12
Tablo 2.4. Alfa talasemiye neden olan non-delesyonel mutasyonların listesi................23
Tablo 2.5. Alfa talasemilerin klinik özellikleri...............................................................29
Tablo 3.1. ARMS yönteminde kullanılan primerler.......................................................44
Tablo 3.2. ARMS yönteminde kullanılan β-talasemi mutasyonlarına özgü primerler...45
Tablo 3.3. Gap PCR yönteminde kullan ılan α-talasemi mutasyonlar ına özgü
primerler..........................................................................................................................48
Tablo 3.4. α globin geni primer dizileri.........................................................................50
1
Tablo 3.5. α globin geni primer dizileri.........................................................................51
2
Tablo 4.1. Olguların hematolojik verileri ve hemoglobin tipleri....................................58
Tablo 4.2. Y ailesinin hematolojik verileri ve mutasyon tipleri.....................................60
Tablo 4.3. B ailesinin hematolojik verileri ve mutasyon tipleri.....................................65

ix