Dissertation Tobias Maierhofer + Referenzen aktuell 11

176 Pages·2012·7 MB·German

Funktionelle Charakterisierung
von SLAC1-homologen Anionenkanälen
aus Arabidopsis thaliana

Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von
Tobias Maierhofer
aus Bad Abbach

Würzburg 2012

Eingereicht am:……………….….....

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender:……………………………..…..

1. Gutachter: Prof. Dr. Rainer Hedrich

2. Gutachter: Prof. Dr. Heinz Rennenberg

Tag des Promotionskolloquiums:…………..…………………

Doktorurkunde ausgehändigt am:……………………………..

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ......................................................................................................................... 1
1.1 Nitrat-Transport in Pflanzen .......................................................................................... 3
1.1.1 Nitrat-Aufnahme .................................................................................................. 3
1.1.2 Das Niedrig-Affinitäts-Transportsystem (LATS)................................................ 4
1.1.3 Das Hoch-Affinitäts-Transportsystem (HATS) ................................................... 5
1.1.4 Nitrataufnahme in die Xylemgefäße .................................................................... 6
1.1.5 Nitrattransport zu den Verbrauchsorganen .......................................................... 6
1.1.6 Nitratverteilung in der Zelle ................................................................................ 8
1.1.7 Stickstoff-Assimilationswege ............................................................................ 10
1.1.8 Nitrat in Schließzellen ....................................................................................... 11
1.2 Die Stomata.................................................................................................................. 12
1.2.1 Die Stomaöffnung .............................................................................................. 13
1.2.1.1 Die H+-ATPase ...................................................................................... 14
1.2.1.2 Beteiligung von Kalium ........................................................................ 15
1.2.1.3 Beteiligung von Anionen ...................................................................... 16
1.2.1.4 Beteiligung von Zuckern ....................................................................... 17
1.2.2 Der Stomaschluss ............................................................................................... 18
1.2.2.1 ABA-Biosynthese und -Transport ......................................................... 19
1.2.2.6 ABA-Rezeptoren und ABA-Signalkaskade .......................................... 21
1.2.2.7 Die Rolle von Phosphatasen in der ABA-Antwort ............................... 23
1.2.2.8 Die Rolle von Kinasen in der ABA-Antwort ........................................ 25
1.2.2.8.1 Ca2+-unabhängige Proteinkinasen ...................................................... 25
1.2.2.8.2 Ca2+-abhängige Proteinkinasen .......................................................... 26
1.2.2.8.3 Phosphorylierungsziele der ABA-aktivierten Proteinkinasen ............ 29
1.2.2.8.4 Beteiligung von Anionenkanälen ....................................................... 30
1.2.2.8.4.1 S-Typ-Anionenkanäle ..................................................................... 31
1.2.2.8.4.2 R-Typ-Anionenkanäle ..................................................................... 34
1.2.2.8.5 Beteiligung von Kaliumkanälen ......................................................... 36
1.3 Zielsetzung der Arbeit ................................................................................................. 38
2 Material und Methoden ................................................................................................... 41
2.1 Verwendetes Pflanzenmaterial .................................................................................... 41
2.2 Das GUS-Reportergen-System .................................................................................... 41
2.2.1 Histochemische Färbung der Glucuronidase-Aktivität ..................................... 42
2.2.2 Einbettung und mikroskopische Analyse der GUS-Färbung ............................. 43
2.3 Bestimmung des Nitratgehalts in Arabidopsis Pflanzen ............................................. 44
2.4 Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) .............................................................................. 45
2.5 USER Klonierung ........................................................................................................ 46
2.6 Mutagenese .................................................................................................................. 48
2.7 Plasmid-Isolierung ....................................................................................................... 48
2.8 In vitro Transkription (IVT) ........................................................................................ 49
2.9 Das heterologe Expressionssystem der Xenopus Oozyten .......................................... 51
2.9.1 Präparation der Xenopus Oozyten ..................................................................... 51
2.9.2 Injektion der cRNA in Oozyten ......................................................................... 52
2.10 Nitrat-Efflux Messungen ........................................................................................... 52
2.11 Transiente Transformation von Mesophyll Protoplasten........................................... 53
2.12 Fluoreszenz-Mikroskopische Untersuchungen .......................................................... 55
2.12.1 Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ....................................... 55
2.12.2 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) ........................................... 56
2.13 Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Technik (DEVC) .......................................... 57
2.13.1 Messprinzip ...................................................................................................... 57
2.13.2 Konventionen ................................................................................................... 58
2.13.3 Meßaufbau ....................................................................................................... 58
2.13.4 Elektroden ........................................................................................................ 59
2.13.5 Datenerfassung ................................................................................................ 59
2.13.6 Messlösungen für die Elektrophysiologie ....................................................... 61
2.13.7 Biophysikalische Grundlagen und Datenanalyse ............................................ 62
2.13.8 Bestimmung von Umkehrpotentialen und relativen Permeabilitäten .............. 62
2.14 Verwendete Materialien ............................................................................................. 64
3. Ergebnisse ...................................................................................................................... 65
3.1 S-Typ Anionenkanäle in Schließzellen........................................................................ 66
3.1.1 Expression von SLAH3 in Schließzellen .......................................................... 66
3.1.2 Elektrophysiologische Charakterisierung von SLAH3 ..................................... 68
3.1.2.1 Expression von SLAH3 in Xenopus Oozyten ....................................... 68
3.1.2.2 Anionenselektivität von SLAH3 ........................................................... 70
3.1.2.3 Aktivierung von SLAH3 durch CDPKs ................................................ 72
3.1.2.4 Aktivierung von SLAH3 durch SnRKs ................................................. 74
3.1.2.5 Aktivierung von SLAH3 durch CIPKs ................................................. 76
3.1.2.6 Spannungsabhängige Aktivierung von SLAH3 .................................... 78
3.1.2.7 Nitratabhängige Aktivierung von SLAH3 ............................................ 79
3.1.2.8 Phosphorylierung von SLAH3 .............................................................. 85
3.1.2.9 Negative Regulation der Aktivität von SLAH3 durch ABI1 ................ 88
3.2 S-Typ Anionenkanäle in der Wurzel ........................................................................... 91
3.2.1 Expression von SLAH2 in der Wurzel .............................................................. 91
3.2.2 Elektrophysiologische Charakterisierung von SLAH2 ..................................... 93
3.2.2.1 Expression von SLAH2 in Xenopus Oozyten ....................................... 93
3.2.2.2 Anionenselektivität von SLAH2 ........................................................... 95
3.2.2.3 Nitratabhängige Aktivierung von SLAH2 ............................................ 98
3.2.2.4 Aktivierung von SLAH2 durch CDPKs .............................................. 102
3.1.2.5 Aktivierung von SLAH2 durch SnRKs ............................................... 104
3.2.3 Funktion von SLAH2 in der Wurzel ............................................................... 106
4. Diskussion .................................................................................................................... 108
4.1 Expressionsmuster der S-Typ-Anionenkanäle........................................................... 108
4.2 Aktivierung von S-Typ-Anionenkanälen durch Proteinkinasen ................................ 110
4.3 Nitrat als Ligand für die Aktivierung von S-Typ-Anionenkanälen ........................... 113
4.4 Negative Regulation der S-Typ-Anionenkanäle ........................................................ 116
4.5 Physiologische Relevanz von SLAH3 ....................................................................... 117
4.6 Physiologische Relevanz von SLAH2 ....................................................................... 120
5. Zusammenfassung........................................................................................................ 126
6. Summary ...................................................................................................................... 128
7. Anhang ......................................................................................................................... 130
7.1 Literaturliste ............................................................................................................... 130
7.2 Abbildungsverzeichnis............................................................................................... 158
7.3 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................. 160
7.4 Lebenslauf .................................................................................................................. 163
7.5 Publikationsliste ......................................................................................................... 164
7.6 Danksagung ............................................................................................................... 165
8 Eidesstattliche Erklärung .............................................................................................. 167

Einleitung
1. Einleitung
Die Synthese grundlegender Bausteine des Lebens, wie z.B. Nukleotide, Aminosäuren
und Proteine, beruht auf der Verfügbarkeit von Stickstoff. Deshalb stellt Stickstoff den
mineralischen Nährstoff dar, den Pflanzen in den größten Mengen benötigen und der am
häufigsten das Wachstum und den Ertrag limitiert. Pflanzen sind jedoch nicht in der Lage,
atmosphärischen Stickstoff direkt zu verwenden und sind daher auf andere
Stickstoffformen angewiesen. Der Anteil an anorganischen oder organischen
Stickstoffverbindungen an der Nährstoffversorgung hängt einerseits von den
Pflanzeneigenschaften, als auch von der Bodenbeschaffenheit ab. In arktischen, borealen,
gemäßigten, mediterranen oder alpinen Ökosystemen ist eine Vielzahl von
Pflanzenspezies in der Lage organische Stickstoffquellen, wie z.B. Ureide, Aminosäuren,
kleine Peptide oder lösliche Proteine zu verwerten (Nasholm et al., 2009; Rentsch et al.,
2007). Unter klimatisch kontrollierten Bedingungen, wie in gemäßigten Klimazonen oder
Gewächshäusern, verarbeiten Pflanzen jedoch überwiegend anorganische
Stickstoffverbindungen. Deshalb enthalten Düngemittel vorwiegend Nitrat, Ammonium
oder Harnstoff (http://www.fertilizer.org/ifa/). Der Großteil des Gesamtstickstoffs im
Boden (>98%) liegt aber in organischer Form vor. Die Umwandlung in anorganische
Formen, wie Ammonium, Nitrit und Nitrat, erfolgt durch im Boden lebende
Mikroorganismen.
Eine weitere Möglichkeit der Stickstoffaufnahme bietet sich durch die Symbiose mit
anderen Organismen. So sind Leguminosen durch die Interaktion zwischen ihren Wurzeln
und Bakterien in der Lage in spezialisierten Organen, den sogenannten Nodulen,
Stickstoff aus der Atmosphäre zu fixieren (Brewin, 1991). In einer ähnlichen Art und
Weise wird die Nährstoffverwertung durch die Symbiose zwischen Pflanzen und Pilzen
erhöht. Dabei ist das Mykorrhiza-System für die Aufnahme der Nährstoffe
verantwortlich, während der pflanzliche Partner dem Pilz Kohlenwasserstoffe zur
Verfügung stellt (Jin et al., 2005). Obwohl solche Symbiosen in natürlichen Ökosystemen
eine wichtige Rolle spielen, nimmt ein Großteil der Pflanzen Stickstoffverbindungen
hauptsächlich über die Wurzeln auf. Somit finden an diesem Organ die größten
Verschiebungen von N-Formen zwischen Pflanze und Boden statt.
Die heute im Boden vorhandenen Stickstoffverbindungen wurden einst durch abiotische
und biotische Prozesse aus atmosphärischem Stickstoff gebildet. In der frühen
Erdgeschichte entstand NO durch die Energie von Blitzen als erste Stickstoffform aus N
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Einleitung
und CO , in der bis dahin nahezu sauerstofffreien Atmosphäre. Dieses NO reagierte
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anschließend in den Ozeanen zu Nitrit und Nitrat (Canfield et al., 2006). Die frühen
Lebensformen, wie Archae und Bakterien, entwickelten Strategien, dieses Nitrat in der
Abwesenheit von Sauerstoff als Elektronenakzeptor in der Atmungskette zu verwenden
(Pina-Ochoa et al., 2010). Einige dieser Bakterien sind in der Lage bis zu 800mM Nitrat
in ihrer Vakuole zu akkumulieren (Schulz-Vogt, 2006). Es konnten Hinweise gefunden
werden, dass bereits in diesen Bakterien frühe Versionen von Anionenkanälen/-
Transportern existieren, welche benötigt werden, um diese hohen Konzentrationen an
Nitrat anzureichern (Mussmann et al., 2007).
Ein Rückgang in der abiotischen N-Fixierung nach der Entstehung von Leben resultierte
möglicherweise in einer Stickstoffkrise, welche die Entwicklung biologischer
Stickstofffixierungsmechanismen vorantrieb. Jedoch erst durch das Auftreten aerober
Organismen (Zyanobakterien) und der damit verbundene Anstieg der
Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre ermöglichte den raschen Anstieg der
Nitratproduktion (Canfield et al., 2010). Der Mensch ist schließlich für eine sprunghafte
Erhöhung der Ammoniumproduktion durch die Entwicklung des Haber-Bosch-
Verfahrens am Anfang des 20. Jahrhunderts verantwortlich. Durch die massive Düngung
des Bodens mit Ammonium stieg gleichzeitig die Menge an Stickstoff und Nitrat im
Erdreich rapide an.
Die Gattung Arabidopsis entwickelte sich vor ca. 42 Millionen Jahren innerhalb der
Familie der Brassicaceae (Beilstein et al., 2010). Somit waren schon die evolutionären
Vorfahren der Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana) N-Formen im Boden ausgesetzt
und mussten Mechanismen zur Aufnahme und zum Transport der anorganischen
Stickstoffverbindungen entwickeln.
Die Konzentration dieser Verbindungen im Boden ist sehr variabel und hängt stark von
den Bodenbeschaffenheiten, Einsatz von Düngemitteln oder der Menge an
Mikroorganismen ab. Die Nitratkonzentration im Boden kann zwischen wenigen 100 µM
bis hin zu 70 mM schwanken (Bache, 1995; Dechorgnat et al., 2011). Aufgrund dieser
hohen Schwankungsbreite in der Nitratverfügbarkeit im Boden mussten Pflanzen fein
regulierbare Transportmechanismen für die Stickstoffaufnahme entwickeln.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Transport des Anions Nitrat und dessen Rolle
beim Stomaschluss untersucht. Deshalb wird in den folgenden Kapiteln der Transport
dieser Stickstoffverbindung im Detail beschrieben.
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