Dissertation Anika Susanne Volkmann

106 Pages·2010·1.35 MB·German

Aus der Universitätsklinik für
Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie Tübingen
Ärztlicher Direktor: Professor Dr. Dr. h.c. G. Ziemer

In vitro Untersuchung zum Einfluss von DEHP auf die
Endothelaktivierung

Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Zahnheilkunde

der Medizinischen Fakultät
der Eberhard Karls Universität
zu Tübingen

vorgelegt von
Anika Susanne Volkmann
aus
Viersen

2010
Dekan: Professor Dr. I. B. Autenrieth
1. Berichterstatter: Privatdozent Dr. H.-P. Wendel
2. Berichterstatter: Professor Dr. J. Geis-Gerstorfer
„Die Wissenschaft ist der Verstand der Welt, die Kunst ihre Seele“
Maxim Gorki 1868-1936

Meinen Eltern und meinem Bruder
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS--------------------------------------------------------------------- 1 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS------------------------------------------------------------ 5 -
1 EINLEITUNG------------------------------------------------------------------------------ 8 -
1.1 Thematische Einführung --------------------------------------------------------- 8 -
1.2 Endothelaktivierung-------------------------------------------------------------- 10 -
1.3 Polyvinylchlorid-------------------------------------------------------------------- 11 -
1.3.1 Weichmacher --------------------------------------------------------------------- 12 -
1.3.2 Phthalate--------------------------------------------------------------------------- 12 -
1.4 Di-(2-ethylhexyl)phthalat-------------------------------------------------------- 13 -
1.4.1 Problematik------------------------------------------------------------------------ 13 -
1.4.2 Toxizität----------------------------------------------------------------------------- 14 -
1.4.3 Exposition im Medizinbereich------------------------------------------------- 15 -
1.4.4 Exposition im Alltag ------------------------------------------------------------- 16 -
1.4.5 Maßnahmen und Lösungsvorschläge-------------------------------------- 17 -
1.5 Tri(2-ethylhexyl)trimellitat------------------------------------------------------ 18 -
1.5.1 noDOP® ---------------------------------------------------------------------------- 18 -
1.6 Carmeda® BioActive Surface-------------------------------------------------- 19 -
1.7 Fragestellung und Ziel der Arbeit ------------------------------------------- 20 -
2 MATERIAL UND METHODEN----------------------------------------------------- 21 -
2.1 Untersuchungsmaterial--------------------------------------------------------- 21 -
2.2 Versuchsaufbau ------------------------------------------------------------------- 22 -
2.2.1 Chandler-Loop-Modell---------------------------------------------------------- 22 -
- 1 -
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2 Zellkulturen------------------------------------------------------------------------ 23 -
2.2.2.1 Material und Geräte--------------------------------------------------------- 23 -
2.2.2.2 Kulturbedingungen ---------------------------------------------------------- 24 -
2.2.2.3 Endothelzellen der Vena saphena -------------------------------------- 25 -
2.2.2.3.1 Isolierung, Kultivierung und Subkultivierung-------------------- 25 -
2.2.2.4 Test auf Mykoplasmen ----------------------------------------------------- 26 -
2.2.2.5 Zellzählung -------------------------------------------------------------------- 27 -
2.2.2.6 HUVEC------------------------------------------------------------------------- 27 -
2.3 Versuchsablauf -------------------------------------------------------------------- 28 -
2.3.1 Probengewinnung --------------------------------------------------------------- 28 -
2.3.1.1 Materialien und Geräte----------------------------------------------------- 28 -
2.3.1.2 Probanden--------------------------------------------------------------------- 28 -
2.3.1.3 Blutabnahme------------------------------------------------------------------ 28 -
2.3.1.4 Rezirkulation ------------------------------------------------------------------ 29 -
2.3.1.5 Zentrifugation ----------------------------------------------------------------- 29 -
2.3.1.6 Einfrieren des Serums------------------------------------------------------ 29 -
2.3.2 Zellkulturversuch----------------------------------------------------------------- 29 -
2.3.2.1 Aktivierungen der Endothelzellen---------------------------------------- 29 -
2.4 Untersuchungsmethoden------------------------------------------------------ 31 -
2.4.1 Analyse der Serumproben auf DEHP und Metaboliten---------------- 31 -
2.4.1.1 Durchführung ----------------------------------------------------------------- 31 -
2.4.2 Analyse der Serumproben auf IL-1β und TNF-α mittels ELISA ----- 32 -
2.4.2.1 Prinzip--------------------------------------------------------------------------- 32 -
2.4.2.2 Material und Geräte--------------------------------------------------------- 32 -
2.4.2.3 Analyse auf IL-1β------------------------------------------------------------ 33 -
2.4.2.4 Analyse auf TNF-α----------------------------------------------------------- 33 -
2.4.3 Analyse von ICAM-1 mittels Durchflusszytometrie---------------------- 34 -
2.4.3.1 Prinzip--------------------------------------------------------------------------- 34 -
2.4.3.2 Material und Geräte--------------------------------------------------------- 34 -
2.4.3.3 Durchführung ----------------------------------------------------------------- 34 -
2.4.4 Analyse von E-Selektin, ICAM-1, VCAM-1 mittels Real-Time PCR- 35 -
- 2 -
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.4.1 Prinzip--------------------------------------------------------------------------- 35 -
2.4.4.2 Material und Geräte--------------------------------------------------------- 36 -
2.4.4.3 Extraktion der Gesamt-RNA und Real-Time PCR ------------------ 36 -
2.4.4.4 Relative Quantifizierung---------------------------------------------------- 38 -
2.4.5 Analyse von E-Selektin und I-CAM mittels Western Blot-------------- 38 -
2.4.5.1 Prinzip--------------------------------------------------------------------------- 38 -
2.4.5.2 Material und Geräte--------------------------------------------------------- 38 -
2.4.5.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese---------------------------------- 39 -
2.4.5.4 Western- Immunblotting nach SDS-PAGE---------------------------- 40 -
2.5 Statistik------------------------------------------------------------------------------- 41 -
3 ERGEBNISSE-------------------------------------------------------------------------- 42 -
3.1 Analyse der Serumproben auf DEHP und Metaboliten -------------- 42 -
3.1.1 Analyse auf Di(2-ethylhexyl)phthalat: DEHP ----------------------------- 43 -
3.1.2 Analyse auf Mono(2-ethylhexyl)phthalat: MEHP------------------------ 44 -
3.1.3 Analyse auf Mono(2-ethyl-5-hydoxyhexyl)phthalat: 5OH-MEHP---- 45 -
3.1.4 Analyse auf Mono(2-ethyl-5-oxohexyl)phthalat: 5oxo-MEHP-------- 46 -
3.1.5 Analyse auf 2-Ethylhexanol--------------------------------------------------- 47 -
3.2 Analyse der Serumproben auf Zytokine----------------------------------- 50 -
3.2.1 Interleukin-1β --------------------------------------------------------------------- 50 -
3.2.2 TNF-α------------------------------------------------------------------------------- 53 -
3.3 Analyse der Adhäsionsmoleküle -------------------------------------------- 55 -
3.3.1 Analyse der ICAM-1-Expression mittels Durchflusszytometrie------ 55 -
3.3.1.1 HUVEC------------------------------------------------------------------------- 56 -
3.3.1.2 Endothelzellen der Vena saphena -------------------------------------- 59 -
3.3.2 Analyse der Adhäsionsmoleküle mittels Real-Time PCR------------- 61 -
3.3.2.1 ICAM-1-------------------------------------------------------------------------- 61 -
3.3.2.1.1 HUVEC-------------------------------------------------------------------- 62 -
3.3.2.1.2 Endothelzellen der Vena saphena--------------------------------- 62 -
3.3.2.2 VCAM-1 ------------------------------------------------------------------------ 63 -
- 3 -
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2.2.1 HUVEC-------------------------------------------------------------------- 63 -
3.3.2.2.2 Endothelzellen der Vena saphena--------------------------------- 64 -
3.3.2.3 E-Selektin---------------------------------------------------------------------- 65 -
3.3.2.3.1 HUVEC-------------------------------------------------------------------- 65 -
3.3.2.3.2 Endothelzellen der Vena saphena--------------------------------- 66 -
3.3.2.4 Positivkontrollen-------------------------------------------------------------- 66 -
3.3.3 Analyse der Adhäsionsmoleküle mittels Western Blot------------------- 68 -
3.4 Zusammenfassung der Ergebnisse----------------------------------------- 70 -
4 DISKUSSION--------------------------------------------------------------------------- 73 -
4.1 Hintergrund des vorliegenden Versuches-------------------------------- 73 -
4.2 Methodische Voraussetzung-------------------------------------------------- 74 -
4.3 Die Freisetzung von DEHP aus PVC-Schläuchen---------------------- 75 -
4.4 Endothelaktivierung durch DEHP-Exposition--------------------------- 81 -
4.4.1 Expression von Zytokinen----------------------------------------------------- 82 -
4.4.2 Expression von Adhäsionsmolekülen -------------------------------------- 85 -
4.5 Schlussfolgerung ----------------------------------------------------------------- 89 -
5 ZUSAMENFASSUNG---------------------------------------------------------------- 91 -
6 LITERATUR----------------------------------------------------------------------------- 93 -
7 ANHANG------------------------------------------------------------------------------ - 103 -
7.1 Danksagung---------------------------------------------------------------------- - 103 -
- 4 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis
“ Zoll
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
2cx-MMHP Mono(2-(carboxymethyl)hexyl)phthalate
5cx-MEPP Mono(2-ethyl-5-carboxypentyl)-phthalat
5OH-MEHP Mono(2-ethyl-5-hydoxyhexyl)phthalat
5oxo-MEHP Mono(2-ethyl-5-oxohexyl)phthalat
Abb. Abbildung
BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte
BSTFA Bis(trimethylsilyl)-trifluoracetamid
bw Body weight
bzw. beziehungsweise
C Kohlenstoff
CBAS Carmeda® BioActive Surface
CD Cluster of differentiation molecule
cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid
cm Zentimeter
CO Kohlenstoffdioxid
2
CT Threshold Cycle, Crossing Point
D Day
DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindole.2HCl. H O.
2
DEHP Di(2-ethylhexyl)phthalat
DIN Deutsches Institut für Normung
DMSO Dimethylsulfoxid
DNS Desoxyribonukleinsäure
EC Endothelzelle
ECMO Extrakorporale Membranoxygenierung
EH 2-Ethylhexanol
- 5 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al. et alii
EU Europäische Union
FACS Fluorescence activated cell sorting
FCS Fetales Kälberserum
G Gramm
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GC Gaschromatographie
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic
hum. Human
HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cell
ICAM-1 Inter-Cellular Adhesion Molecule 1
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
ISO Internationale Organisation für Normung
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
l Liter
m/z Masse-zu-Ladungs-Verhältnis
m2 Quadratmeter
mA Milliamper
MEHP Mono(2-ethylhexyl)phthalat
mg Milligramm
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
mRNA Messenger Ribonucleic acid
MS Massenspektrometrie
N Teilchenzahl
N Stickstoff
2
Na SO Natriumsulfat
2 4
- 6 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
NaCl Natriumchlorid
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
NaHCO Natriumhydrogencarbonat
3
NaOH Natriumhydroxid
ng Nanogramm
nm Nanometer
nM Nanomol
NOAEL No observable adverse effect level
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
pg Pikogramm
PVC Polyvinylchlorid
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
SIRS Systemic-Inflammatory-Response-Syndrome
Tab. Tabelle
TBS Tris Buffered Saline
TDI Tolerable Daily Intake
TEHTM Tri(2-ethylhexyl)trimellitat
TNF Tumornekrosefaktor
TNS Trypsin Neutralizing Solution
U Unit
V. Vena
VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
z.B. zum Beispiel

- 7 -