Dissertation Andreas Comouth

156 Pages·2012·34.98 MB·English

INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorw(cid:252)rde
der
Naturwissenschaftlich - Mathematischen
Gesamtfakult(cid:228)t
der Ruprecht - Karls - Universit(cid:228)t
Heidelberg
vorgelegt von
Dipl.-Ing. Andreas Comouth
aus Jena
Tag der m(cid:252)ndlichen Pr(cid:252)fung: 18.04.2012

Kontrollierte Deposition synthetischer
Nanopartikel auf Lungenzellen an der
Luft-Fl(cid:252)ssigkeits-Grenzschicht
f(cid:252)r toxikologische Untersuchungen
Gutachter: Prof. Dr. Thomas Leisner
Prof. Dr. Henning Bockhorn
Kurzfassung
In der Dosimetrie und Charakterisierung relevanter Materialeigenschaften sto-
(cid:255)en etablierte Expositionsverfahren zur Bewertung der toxischen Wirkung von
nanoskaligen Partikeln an ihre Grenzen. Zur Untersuchung der Wirkung inha-
lierter Partikel wird daher zunehmend das Verfahren zur in vitro Exposition von
Lungenzellen an der Luft-Fl(cid:252)ssigkeits-Grenzschicht eingesetzt.
In dieser Arbeit wurde ein entsprechendes Expositionssystem aufgebaut, im De-
tail charakterisiert und f(cid:252)r die Untersuchung von Nanopartikeln eingesetzt. Zur
Vorhersage der Depositionse(cid:30)zienzen wurde ein (cid:29)uid-dynamisches Modell f(cid:252)r
Partikelgr(cid:246)(cid:255)en zwischen 20 nm und 2 µm entwickelt und experimentell validiert.
Die relativ geringe Depositionse(cid:30)zienz der Expositionskammern von ca. 1% wur-
de durch ein elektrostatisches Feld um mehr als eine Gr(cid:246)(cid:255)enordnung erh(cid:246)ht, so
dass die Simulation akut erh(cid:246)hter Partikelbelastungen m(cid:246)glich ist.
Die Funktionst(cid:252)chtigkeit des Expositionssystems wurde mit luftgetragenen Me-
talloxidnanopartikeln (TiO , SiO ) und Ru(cid:255)aerosol demonstriert. Dazu wurden
2 2
verschiedene Aerosolerzeugungsverfahren getestet und die Aerosole insbesonde-
re bez(cid:252)glich ihres Agglomerationszustands und Residualpartikelanteils charakte-
risiert. Zur Bestimmung der deponierten Dosis wurden verschiedene Methoden
untersucht und deren Anwendungsbereiche eingegrenzt. Die aus den Expositions-
versuchen ermittelten wirksamen Dosen wurden mit realistischen Partikelbela-
stungen verglichen und den beobachteten Reaktionen der A549 Lungenzelllinie
gegen(cid:252)bergestellt. Akute in(cid:29)ammatorische und zytotoxische Zellreaktionen wur-
den nur nach Exposition mit unnat(cid:252)rlich hohen Dosen an SiO Nanopartikeln
2
beobachtet.
Abstract
Established exposure procedures reach their limits in the assessment of toxic
hazard of nanomaterials regarding dosimetry and characterisation of relevant ma-
terial properties. Hence in vitro procedures for cell exposure of lung cells at the
air liquid interface are used more frequently to evaluate the toxic impact of inha-
led particles.
In this work an according exposure setup was build, characterized, and applied
for the investigation of nanoparticles. In order to predict the deposition e(cid:30)ciency
a (cid:29)uid dynamic model was developed and validated for particle sizes between
20 nm and 2 µm. The deposition e(cid:30)ciency of the exposure chamber of about 1%
was increased by more than one order of magnitude by applying an electrostatic
(cid:28)eld. This allows now simulation of acute increased particle levels.
The operational reliability of the exposure system was demonstrated with metal
oxide nanoparticles and soot aerosols. Various procedures for aerosol generati-
on were tested. Agglomeration state and residual fraction of the particles were
characterized. Di(cid:27)erent methods for determination of deposited doses and their
range of application were investigated. The e(cid:27)ective dose values determined in ex-
posure experiments were compared to realistic particle loadings of human lungs
and related to reactions of A549 lung cells. Acute in(cid:29)ammatory and cytotoxic
cell reactions were only observed after exposure to extremely high doses of SiO
2
nanoparticles.

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Biologischer Hintergrund 3
2.1 Dosimetrie und relevante Dosisgr(cid:246)(cid:255)en . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2 Zellmodellsysteme f(cid:252)r in vitro Versuche . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.3 Submerse Exposition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.4 Exposition an der Luft - Fl(cid:252)ssigkeits - Grenzschicht . . . . . . . . 10
2.5 Biologische Endpunkte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3 Methodische Grundlagen 14
3.1 Nanopartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.1.1 Kinetik der Agglomeratbildung . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.1.2 Verfahren zur Deagglomeration . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.1.3 Methoden zur Stabilisierung (cid:29)(cid:252)ssiger Suspensionen . . . . 18
3.2 Deposition luftgetragener Nanopartikel auf Lungenzellen . . . . . 22
3.2.1 Aerosolerzeugung mit dem Elektrospray und Atomizer . . 23
3.2.2 Aerosolcharakterisierung und Dosisbestimmung . . . . . . 25
3.3 Simulation der Depositionse(cid:30)zienz . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4 Aufbau, Modellierung und Versuchsdurchf(cid:252)hrung 35
4.1 Aerosolerzeugung und Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . 35
4.1.1 Erzeugung stabiler Partikelsuspensionen . . . . . . . . . . 37
4.1.2 Synthese von SiO Partikeln zur direkten Exposition . . . 39
2
4.1.3 Charakterisierung der Agglomerat- und Residualanteile . . 41
4.2 Aufbau der Expositionseinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.2.1 Modi(cid:28)kation der Expositionskammer zur elektrostatischen
Deposition von Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.2 Messung der Depositionse(cid:30)zienz . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.3 Simulation der Depositionse(cid:30)zienz . . . . . . . . . . . . . 48
4.3 Durchf(cid:252)hrung der Expositionsversuche . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.3.1 Blindversuche mit Partikelfreier Luft . . . . . . . . . . . . 51
4.3.2 Exposition mit SiO Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . 52
2
4.3.3 Exposition mit TiO Nanopartikeln . . . . . . . . . . . . . 55
2
4.3.4 Exposition mit Kohlensto(cid:27)partikeln . . . . . . . . . . . . . 55
5 Resultate 58
5.1 Residual- und Agglomeratanteil der Aerosole . . . . . . . . . . . 58
5.1.1 Stabilisierte kommerzielle Suspensionen . . . . . . . . . . . 59
5.1.2 Resuspendierte Metalloxide aus der Gasphasensynthese . . 65
I
Inhaltsverzeichnis
5.1.3 Fl(cid:252)ssigabgeschiedene SiO Partikel aus der Mikrowellen-
2
plasmasynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
5.1.4 Direkte Erzeugung von SiO Nanopartikeln f(cid:252)r Expositi-
2
onsversuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
5.1.5 Reproduzierbarkeit und Stabilit(cid:228)t der Aerosole . . . . . . . 79
5.2 Agglomeratstruktur der Aerosolpartikel . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.3 Zellvertr(cid:228)glichkeit der Anlage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
5.4 Depositionse(cid:30)zienz der Expositionskammer ohne Elektrode . . . . 92
5.4.1 Gr(cid:246)(cid:255)enabh(cid:228)ngigkeit der Depositionse(cid:30)zienz . . . . . . . . 93
5.4.2 Dichteabh(cid:228)ngigkeit der Depositionse(cid:30)zienz . . . . . . . . . 96
5.4.3 Depositionse(cid:30)zienz fraktal(cid:228)hnlicher Agglomerate . . . . . 98
5.4.4 Experimentelle Validierung der Simulation . . . . . . . . . 99
5.5 Depositionse(cid:30)zienz mit Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5.6 Zytotoxische und In(cid:29)ammatorische Wirkung verschiedener Nano-
partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
5.6.1 SiO Partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2
5.6.2 TiO Partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
2
5.6.3 Kohlensto(cid:27) Partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
5.7 Diskussion der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
5.7.1 Gefahr durch Nanopartikel? . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
6 Zusammenfassung 127
7 Ausblick 130
II
1 Einleitung
1 Einleitung
Aufgrund ihrer besonderen physikalischen, chemischen und biologischen Eigen-
schaften werden Nanopartikel in einer Vielzahl von Verfahren und Produkten
angewendet. Sie erm(cid:246)glichen unter anderem die Herstellung und Entwicklung
neuer Verbundwerksto(cid:27)e mit besonderen mechanischen, thermischen, magneti-
schen oder elektrischen Eigenschaften [Wegner et al., 2004]. Die vielen Vorteile
bei der Anwendung nanoskaliger Materialien sind unumstritten. Epidemiologi-
sche Studien belegen allerdings auch eine gesundheitssch(cid:228)dliche Wirkung durch
inhalierte feine und ultrafeine Partikel [Ibald-Mulli et al., 2002], [Pope et al.,
2004], [Pope and Dockery, 2006], [Stoelzel et al., 2007], [Pope et al., 2009]. Die
zunehmende Anwendung von Nanopartikeln erfordert daher auch eine sinnvolle
Risikobewertung der damit einhergehenden Exposition von Mensch und Umwelt.
Da Partikel dieser Gr(cid:246)(cid:255)enordnung in der Lage sind im alveolaren Bereich des
Atemtrakts zu deponieren und dort nur eine sehr d(cid:252)nne Epithelbarriere vorliegt,
kann davon ausgegangen werden, dass die Lunge eine der wesentlichen Pforten
f(cid:252)r Nanopartikel in den menschlichen K(cid:246)rper darstellt [Society, 2004], [Curwin
and Bertke, 2011]. Die epidemiologischen Studien geben allerdings keinen Auf-
schluss (cid:252)ber die f(cid:252)r eine gesundheitssch(cid:228)dliche Wirkung verantwortlichen Parti-
keleigenschaften oder Wirkmechanismen. Das Aufstellen gesetzlicher Regularien
im Umgang mit Nanomaterialien zum wirksamen Schutz der Bev(cid:246)lkerung und
von Arbeitnehmern erfordert aber gerade ein Verst(cid:228)ndnis der zugrundeliegenden
physiologischen Wirkmechanismen. Neben der Beurteilung der Exposition durch
spezi(cid:28)sche Partikelsorten ist dabei insbesondere die Bestimmung des toxischen
PotentialszurBewertungdervonihnenausgehendenGefahrerforderlich.Ausdie-
sem Grund machte sich das durch die Deutche Forschungsgemeinschaft, im Rah-
men des Schwerpunktprogramms 1313 gef(cid:246)rderte, NANO-SYNCC Projekt (Na-
noparticles: Synthesis, characterisation, and cellular e(cid:27)ects) die Beurteilung der
toxischen Wirkung von Nanopartikeln auf alveolare Epithelzellen und Makropha-
gen, sowie die Identi(cid:28)zierung der daf(cid:252)r verantwortlichen Partikelparameter und
zugrundeliegenden Mechanismen zur Kernaufgabe. Da gasphasensynthetisierte
Metalloxide derzeit die kommerziell relevantesten und neben Kohlensto(cid:27)verbin-
dungen am h(cid:228)u(cid:28)gsten synthetisierten Nanomaterialien darstellen [Wegner et al.,
2004], [Society, 2004] lagen sie im Fokus der im NANO-SYNCC Projekt durch-
gef(cid:252)hrten Untersuchungen. Daher wurden vom Engler Bunte Institut des Karls-
ruher Instituts f(cid:252)r Technologie (KIT) ma(cid:255)geschneiderte Metalloxidnanopartikel
in einem niederdruck Flammensyntheseverahren hergestellt und charakterisiert
[Nalcaci et al., 2011]. Die toxische Wirkung dieser Partikel wurde vom Institut
f(cid:252)r Toxikologie und Genetik des KIT durch die Exposition von Lungenzellen mit
(cid:29)(cid:252)ssigenNanopartikelsuspensionencharakterisiert.Dadasalssubmersbezeichne-
te Verfahren mit (cid:29)(cid:252)ssigen Nanopartikelsuspensionen ein sehr unrealistsiches Ex-
positionsszenario darstellt und die Partikeleigenschaften sowie deponierten Dosen
1
1 Einleitung
nur unzureichend charakterisiert werden k(cid:246)nnen, wurde es in erster Linie als Aus-
wahlpr(cid:252)fverfahren zur Identi(cid:28)zierung besonders toxisch wirkender Partikelsorten
eingesetzt.ZurUntersuchungdertoxischenWirkungunterdeutlichrealistischeren
und wohl de(cid:28)nierten Bedingungen wurden, in Zusammenarbeit des Intituts f(cid:252)r
Meteorologie und Klimaforschung, sowie dem Institut f(cid:252)r Technische Chemie des
KIT, Expositionsversuche an der Luft-Fl(cid:252)ssigkeits-Grenz(cid:29)(cid:228)che (ALI) mit den im
Submersverfahrenalsbesonderspotentidenti(cid:28)ziertenPartikelndurchgef(cid:252)hrt.Ein
in dieser Arbeit behandelter Schwerpunkt liegt in der Bereitstellung der f(cid:252)r ALI
Expositionsversuche notwendigen Aerosole. Diese erfordern eine reproduzierba-
re Resuspendierung der gasphasensynthetisierten Partikel in einem (cid:252)ber mehrere
Stunden stabilen Aerosol mit einem de(cid:28)nierten Agglomeratzustand. Weiterhin
d(cid:252)rfen die Aerosole keine toxischen Gase, Nebendprodukte oder zu gro(cid:255)e Antei-
le an Residualpartikeln enthalten, welche die biologische Wirkung beein(cid:29)ussen
k(cid:246)nnen. Aufgrund der schwachen Zellreaktionen nach einer Metalloxidnanoparti-
kelexposition sind au(cid:255)erdem hohe Partikeldosen erforderlich. Da stabile Konzen-
trationen luftgetragener Partikel nat(cid:252)rlichen Grenzen unterliegen ist ein weiterer
Schwerpunkt dieser Arbeit die Erh(cid:246)hung der Depositionse(cid:30)zienz einer kommerzi-
ellerh(cid:228)ltlichenExpositionskammerdurcheinelektrostatischesFeld.DesWeiteren
wird eine auf dieser Expositionskammer basierende Expositionsanlage zur Durch-
f(cid:252)hrung von ALI Experimenten unter stabilen zellvertr(cid:228)glichen Bedingungen vor-
gestellt. Insbesondere wird auf die Charakterisierung der Depositionse(cid:30)zienz zur
Bestimmung der deponierten Dosis eingegangen. Diese ist erforderlich zur Be-
stimmung der deponierten Dosis der im Rahmen dieser Arbeit durchgef(cid:252)hrten
Expositionsversuche
2