Dissertation Anastasia Messer

271 Pages·2014·35.49 MB·German

Technische Universität Kaiserslautern
Fachbereich Chemie
Fa chrichtung Lebensmittelchemie/Toxikologie
AG Prof. Dr. Dr. Dieter Schrenk

C Z
ROSSTALK ZWISCHEN MURINEN MYELOIDEN ELLEN

UND FREMDSTOFFMETABOLISIERENDEN
H L
EPATOMZELLEN DURCH IGANDEN DES
A R-S
H IGNALWEGES

Vom Fachbereich Chemie der Universität Kaiserslautern
zur Verleihung des akademischen Grades
„Doktor der Naturwissenschaften“
genehmigte

Dissertation

(D 386)

vorgelegt von

Diplom-Chemikerin
Anastasia Messer
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. Dr. Dieter Schrenk
Eröffnung des Promotionsverfahrens: 28.11.2012
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 24.10.2014

Promotionskommission:

Vorsitzender: Prof. Dr. Helmut Sitzmann

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Dr. Dieter Schrenk
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Melanie Esselen

ii
Der experimentelle Teil der vorliegenden Dissertation entstand im Zeitraum von
Dezember 2010 bis Februar 2014 an der Technischen Universität Kaiserslautern
im Fachbereich Chemie, Fachrichtung Lebensmittelchemie und Toxikologie,
im Arbeitskreis von Prof. Dr. Dr. Dieter Schrenk.

I
NHALTSVERZEICHNIS
Abstract ................................................................................................................................... vii
Abstract .................................................................................................................................... ix
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................ xi
Tabellenverzeichnis ................................................................................................................ xv
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................ xvii
1. Einleitung und Fragestellung ............................................................................................. 1
2. Theoretische Grundlagen.................................................................................................... 3
2.1 Immunsystem ................................................................................................................. 3
2.1.1 Zellen des Immunsystems .................................................................................... 4
2.1.1.1 Natürliche Killerzellen, Mastzellen, B- und T-Lymphozyten ................. 5
2.1.1.2 Makrophagen ........................................................................................... 5
2.1.1.3 Dendritische Zellen ................................................................................. 6
2.1.1.4 Granulozyten ........................................................................................... 7
2.1.2 Oberflächenmerkmale von Immunzellen ............................................................. 8
2.2 Arylhydrocarbon Rezeptor ............................................................................................. 9
2.2.1 AhR-Signaltransduktion ..................................................................................... 10
2.2.2 Liganden des AhR .............................................................................................. 12
2.2.2.1 Synthetische Liganden .......................................................................... 12
2.2.2.2 Natürliche Liganden .............................................................................. 13
2.2.3 Rolle des Ah-Rezeptors im Immunsystem ......................................................... 15
2.3 Vitamin D ..................................................................................................................... 16
2.3.1 Vitamin-D-Rezeptor ........................................................................................... 18

i
2.3.1.1 VDR-Signaltransduktion ....................................................................... 19
2.3.2 Rolle des Vitamin-D-Rezeptors im Immunsystem ............................................ 20
2.3.3 Cytochrom P450 Enzyme .................................................................................. 21
2.3.3.1 CYP1-Enzyme ....................................................................................... 21
2.3.3.2 CYP24A1-Enzym .................................................................................. 22
2.4 Interaktion des VDR mit dem AhR.............................................................................. 22
3. Materialien ......................................................................................................................... 25
3.1 Labortiere ..................................................................................................................... 25
3.2 Zelllinien ...................................................................................................................... 25
3.3 Chemikalien, Geräte und Verbrauchsmaterialien ........................................................ 25
4. Methoden ............................................................................................................................ 27
4.1 Primäre murine Knochenmarkzellen ........................................................................... 27
4.1.1 Isolierung primärer muriner Knochenmarkzellen .............................................. 27
4.1.2 Bestimmung der Zellzahl ................................................................................... 28
4.1.3 Kultivierung und Differenzierung primärer Knochenmarkzellen ...................... 29
4.1.4 Behandlung muriner myeloider Zellen .............................................................. 30
4.1.5 Adhärenz und Proliferation von Knochenmarkzellen ........................................ 31
4.2 Zellkultur ...................................................................................................................... 32
4.2.1 Kultivierung von Zelllinien ................................................................................ 32
4.2.2 Subkultivierung von Zelllinien .......................................................................... 33
4.2.3 Aussaat und Behandlung von Zelllinien ............................................................ 33
4.2.4 Einfrieren von Zelllinien .................................................................................... 34
4.3 Extraktion von Kernproteinen ...................................................................................... 36
4.4 Extraktion totaler RNA ................................................................................................ 37
4.5 Biochemische Analysemethoden ................................................................................. 40
4.5.1 Resazurinreduktionstest ..................................................................................... 40
4.5.2 Ethoxyresorufin-O-Deethylase (EROD) Assay ................................................. 41
4.5.2.1 EROD Assay in vitalen Zellen .............................................................. 42
4.5.3 Bicinchoninsäure (BCA) Assay ......................................................................... 44
4.5.4 Real-Time Polymerase Kettenreaktion .............................................................. 46
4.5.4.1 Reverse Transkription ........................................................................... 46
4.5.4.2 Quantitative Real-Time PCR................................................................. 47
4.5.5 Nitritbestimmung nach Griess............................................................................ 51
4.5.6 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) .............................................. 52

ii
4.5.7 SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ....................................... 55
4.5.7.1 Probenvorbereitung ............................................................................... 56
4.5.7.2 Gelelektrophorese .................................................................................. 56
4.5.8 Western Blot und Immunoblot ........................................................................... 58
4.5.9 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) .................................................. 62
4.5.9.1 Hybridisierung von DNA-Einzelsträngen ............................................. 63
4.5.9.2 Probenvorbereitung und Gelelektrophorese .......................................... 64
4.5.9.3 Transfer auf eine Nylonmembran und Crosslink .................................. 65
4.5.9.4 Detektion der Chemilumineszenz ......................................................... 66
4.6 Durchflusszytometrie ................................................................................................... 66
4.7 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).................................................... 69
4.7.1 Probenvorbereitung ............................................................................................ 70
4.7.2 HPLC-Analyse ................................................................................................... 71
4.8 Statistische Auswertung ............................................................................................... 71
5. Ergebnisse........................................................................................................................... 73
5.1 Charakterisierung muriner Knochenmarkzellen .......................................................... 73
5.1.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen ............................................................... 74
5.1.2 Durchflusszytometrische Analyse ...................................................................... 75
5.1.3 Adhärenz und Proliferation ................................................................................ 79
5.2 Einfluss von Mediumüberständen muriner myeloider Zellen auf Hepatomzelllinien . 80
5.2.1 Zellvitalität ......................................................................................................... 80
5.2.2 EROD-Aktivität ................................................................................................. 82
5.2.3 Cytochrom P450 1A1 Genexpression ................................................................ 85
5.3 Einfluss von Mediumüberständen muriner myeloider Zellen auf Hepatomzellen nach
Co-Inkubation mit TCDD ............................................................................................ 86
5.3.1 Zellvitalität ......................................................................................................... 87
5.3.2 EROD-Aktivität ................................................................................................. 88
5.3.3 Cytochrom P450 1A1 Genexpression ................................................................ 90
5.4 Analytik muriner myeloider Zellen .............................................................................. 91
5.4.1 NO-Bestimmung nach Griess ............................................................................ 91
5.4.2 Quantifizierung von Zytokinen .......................................................................... 93
5.5 Einfluss von Zytokinen auf HepG2 ............................................................................. 94
5.5.1 Zellvitalität ......................................................................................................... 94
5.5.2 EROD-Aktivität ................................................................................................. 99
5.6 Einfluss von TCDD und Calcitriol auf myeloide Zellen ........................................... 101

iii
5.6.1 Zellvitalität ....................................................................................................... 102
5.6.2 Zytokinausschüttung ........................................................................................ 104
5.6.2.1 IL-1α .................................................................................................... 105
5.6.2.2 IL-1β .................................................................................................... 106
5.6.2.3 IL-6 ...................................................................................................... 107
5.6.2.4 TNF-α .................................................................................................. 109
5.6.2.5 Stickoxid (NO) .................................................................................... 110
5.6.3 Genexpression .................................................................................................. 112
5.6.3.1 Genexpression der Zytokine ................................................................ 112
5.6.3.2 Genexpression von Cyp1a1 und Cyp24a1 .......................................... 114
5.6.4 Western Blot Analyse ...................................................................................... 123
5.7 Einfluss von TCDD und Calcitriol auf HepG2 .......................................................... 126
5.7.1 Zellvitalität ....................................................................................................... 126
5.7.2 EROD-Aktivität ............................................................................................... 127
5.7.3 Genexpression von CYP1A1 ............................................................................ 128
5.8 Interaktion des VDR mit dem AhR (EMSA) ............................................................. 130
5.9 HPLC-Analyse myeloider Zellen und deren Überstände .......................................... 133
6. Diskussion ......................................................................................................................... 143
6.1 Charakterisierung myeloider Zellen ........................................................................... 144
6.2 Einfluss von Mediumüberständen myeloider Zellen auf Hepatomzellen .................. 147
6.2.1 Zellvitalität ....................................................................................................... 147
6.2.2 CYP1A1-Aktivierung ...................................................................................... 154
6.3 HPLC-Analyse von Mediumüberständen .................................................................. 161
6.4 Vitamin D und TCDD .............................................................................................. 163
3
6.4.1 Zellvitalität und Proliferation ........................................................................... 163
6.4.2 Zytokine ........................................................................................................... 165
6.4.2.1 Einfluss des Calcitriols ........................................................................ 165
6.4.2.2 Einfluss des 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxins ............................ 169
6.4.3 Rezeptoren und CYPs ...................................................................................... 171
6.4.4 Wechselwirkung zwischen AhR und VDR? .................................................... 175
7. Zusammenfassung und Ausblick ................................................................................... 189
8. Literaturverzeichnis ........................................................................................................ 195
9. Anhang .............................................................................................................................. 225

iv
9.1 Weitere Daten ............................................................................................................ 225
9.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ................................................................... 233
9.2.1 Chemikalien ..................................................................................................... 233
9.2.2 Antikörper ........................................................................................................ 235
9.2.3 Kits ................................................................................................................... 236
9.2.4 Verbrauchsmaterialien ..................................................................................... 236
9.2.5 Geräte ............................................................................................................... 237
9.2.6 Software ........................................................................................................... 239
10. Eidesstattliche Erklärung .............................................................................................. 241
11. Lebenslauf ....................................................................................................................... 243

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