Dissertation Abraham 2006

125 Pages·2007·59.83 MB·German

by  Christian Abraham

Dissertation
Christine Winterstein, 2007
Zellulärer Transport von Myelinproteinen
Dissertation
zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften

am Fachbereich Biologie
der Johannes Gutenberg-Universität Mainz

von
Christine Winterstein
geboren am 28.03.1978 in Frankfurt am Main
Mainz, Mai 2007
Tag der mündlichen Prüfung: 14.06.2007
Inhaltsverzeichnis
1 Abstract ..................................................................................................................... 1
2 Einleitung ................................................................................................................... 2
2.1 Oligodendrozyten und das Myelin ........................................................................ 2
2.2 Die Struktur der Myelinmembran......................................................................... 3
2.2.1 Myelin unterteilt sich in Subdomänen __________________________________ 3
2.2.2 Die Biochemische Zusammensetzung des Myelins im ZNS __________________ 4
2.2.2.1 Das Proteolipid Protein (PLP) .................................................................................................... 6
2.2.2.2 Das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) ............................................................................. 8
2.2.2.3 Das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) ................................................................. 8
2.2.3 Die Bildung von Myelin _____________________________________________ 9
2.2.3.1 Die axo-gliale Interaktion ........................................................................................................ 10
2.2.3.2 Der intrazelluläre Transport von Myelinkomponenten .......................................................... 11
2.3 Vesikeltransport und Membranbiogenese .......................................................... 12
2.3.1 Vesikeltransport in polaren Zellen ____________________________________ 12
2.3.2 Endozytose und Recycling __________________________________________ 13
2.3.2.1 Clathrin-vermittelte Endozytose ............................................................................................. 14
2.3.2.2 Clathrin-unabhängige Endozytose .......................................................................................... 14
2.3.3 Endosomales Recycling und Zellmorphogenese _________________________ 16
2.3.4 Sekretorische Lysosomen bzw. Lysosomen-verwandte Organellen (LROs) ____ 16
2.3.5 Exosomen _______________________________________________________ 17
2.4 Fragestellung der Arbeit ..................................................................................... 18
3 Material und Methoden ............................................................................................ 19
3.1 Materialien ........................................................................................................ 19
3.2 Puffer und Nährmedien ..................................................................................... 21
3.3 Antikörper ......................................................................................................... 24
3.3.1 Primärantikörper _________________________________________________ 24
3.3.2 Sekundärantikörper _______________________________________________ 25
3.4 Fluoreszierende Marker ..................................................................................... 26
3.5 Plasmide ............................................................................................................ 26
3.6 Zellkultur ........................................................................................................... 26
Inhaltsverzeichnis
3.6.1 Präparation primärer Oligodendrozyten und gemischter Gehirnkulturen _____ 26
3.6.1.1 Gemischte Gehirnkulturen...................................................................................................... 27
3.6.1.2 Neuronenkill und Abklopfen der Makrophagen ..................................................................... 27
3.6.1.3 Oligodendrozyten-Shake......................................................................................................... 27
3.6.2 Oli-neu Zellen: Kultivierung, Passagieren, Auftauen und Einfrieren __________ 28
3.6.3 Transiente Transfektion von Oli-neu Zellen _____________________________ 29
3.6.3.1 Elektroporation ....................................................................................................................... 29
3.6.3.2 AMAXA Nukleofektion ............................................................................................................ 29
3.6.3.3 Liposomen-basierte Transfektion (Fugene 6, Lipofectamine 2000) ....................................... 29
3.7 Präparation von Myelin und Zellmembranen ..................................................... 30
3.7.1 Isolierung von Myelin aus dem ZNS ___________________________________ 30
3.7.2 Fraktionierung von Myelin __________________________________________ 31
3.7.3 Präparation eines kernfreien Überstandes (PNS) ________________________ 31
3.7.3.1 Aufbrechen von Zellen mit Hilfe einer 22 x G Kanüle ............................................................. 31
3.7.3.2 Aufbrechen von Zellen mit Hilfe eines Cellcrackers ................................................................ 31
3.7.3.3 Aufbrechen von Zellen mit Hilfe einer N -Bombe .................................................................. 32
2
3.7.4 Membranpräparation______________________________________________ 32
3.7.5 Präparation von Myelin-ähnlichen Membranen (MLMs) aus primären
Oligodendrozyten ______________________________________________________ 32
3.7.6 Fraktionierung von oligodendroglialen Zellmembranen ___________________ 32
3.7.7 Präparation von Exosomen _________________________________________ 33
3.8 Das Biotin-Avidin-System ................................................................................... 33
3.8.1 Biotin-bindende Proteine: Avidin, Streptavidin und Neutravidin ____________ 34
3.8.2 Biotinylierung von Molekülen _______________________________________ 34
3.8.2.1 Zelloberflächenbiotinylierung ................................................................................................. 35
3.9 Fluoreszenzmarkierungen von Proteinen und Organellen ................................... 35
3.9.1 Immunfluoreszenz ________________________________________________ 35
3.9.2 Markierung der Recycling-Endosomen mit fluoreszierendem Transferrin _____ 36
3.9.3 Markierung der Lysosomen mit LysoTracker® ___________________________ 36
3.9.4 Detektion biotinylierter Proteine mit fluoreszierendem Streptavidin ________ 36
3.10 Methoden zur Analyse des endosomalen Transports von Myelinproteinen ........ 36
3.10.1 Antikörper-Endozytose ____________________________________________ 36
Inhaltsverzeichnis
3.10.2 Endozytose und Recycling von zelloberflächenbiotinylierten Proteinen ______ 38
3.10.2.1 Pulse Chase-Markierung von Zelloberflächenproteinen mit Sulfo-NHS-SS-Biotin.................. 38
3.10.2.2 Recycling-Analyse von biotinylierten Zelloberflächenproteinen ............................................ 38
3.11 Mikroskopische Analysen................................................................................... 39
3.11.1 Elektronenmikroskopie ____________________________________________ 39
3.11.2 Immuno-Elektronenmikroskopie _____________________________________ 39
3.11.3 Lebendzellmikroskopie_____________________________________________ 40
3.12 Bradford-Test .................................................................................................... 40
3.13 SDS-PAGE .......................................................................................................... 40
3.13.1 Coomassie-Färbung _______________________________________________ 41
3.14 Western-Blot ..................................................................................................... 42
3.14.1 Ponceau-S Färbung ________________________________________________ 42
3.14.2 Immundetektion__________________________________________________ 42
3.15 Klonierung ......................................................................................................... 43
3.15.1 Transformation ___________________________________________________ 43
3.15.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ________________________________ 43
3.15.3 Konzentrationsmessung von DNA-Lösungen ____________________________ 43
3.15.4 Restriktionsverdau ________________________________________________ 44
3.15.5 Aufreinigung von DNA _____________________________________________ 44
3.15.6 Ligation _________________________________________________________ 44
3.15.7 Analyse von DNA _________________________________________________ 44
3.15.7.1 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................................... 44
3.15.8 Amplifizierung von DNA ____________________________________________ 45
3.15.8.1 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ........................................................................................... 45
3.15.9 Sequenzierung ___________________________________________________ 45
4 Ergebnisse ................................................................................................................ 46
4.1 In vitro Modelle zur Analyse des oligodendroglialen Membrantransports ........... 46
4.2 Subzelluläre Lokalisierung von PLP, MAG und MOG in primären Oligodendrozyten
und Oli-neu Zellen ........................................................................................................ 47
4.2.1 PLP, MAG und MOG assoziieren in vitro mit morphologisch unterschiedlichen
Membrandomänen _____________________________________________________ 47
Inhaltsverzeichnis
4.2.2 Biochemische Subfraktionierung von Myelin und oligodendroglialen
Zellmembranen ________________________________________________________ 49
4.2.3 Kolokalisierung von PLP und LAMP1 __________________________________ 50
4.2.4 Immunzytochemische Lokalisierung von PLP und LAMP1 an der Spitze von
wachsenden Membranfortsätzen __________________________________________ 53
4.3 Exozytose von Myelinproteinen in Oligodendrozyten ......................................... 55
4.3.1 Nachweis der Exozytose von PLP enthaltenden LE/Lys in Oli-neu Zellen ______ 55
4.3.2 Ca2+-abhängige Translokation von PLP, MAG und MOG an die Plasmamembran
von pOl ______________________________________________________________ 57
4.3.3 Präparation von MLMs nach Ionomycin-Behandlung _____________________ 64
4.3.4 Exosomen-Präparation aus dem Kulturüberstand von pOl _________________ 65
4.4 Analysen zum endosomalen Transport von PLP, MAG und MOG ........................ 67
4.4.1 Unter Steady State-Bedingungen ist ausschließlich PLP in endosomalen
Kompartimenten angereichert ____________________________________________ 67
4.4.2 Endozytose von zelloberflächenbiotinylierten Myelinproteinen ____________ 68
4.4.3 Morphologischer Nachweis der Endozytose von Myelinproteinen mit Antikörpern
72
4.4.4 PLP, MAG und MOG endozytieren in unterschiedliche endosomale
Zielkompartimente _____________________________________________________ 76
4.4.5 Clathrin-vermittelte Endozytose von MAG und MOG _____________________ 79
4.4.6 Clathrin-unabhängige Endozytose von PLP _____________________________ 81
4.5 Endosomales Recycling von PLP, MAG und MOG in primären Oligodendrozyten . 83
5 Diskussion ................................................................................................................ 87
5.1 In vitro Transportanalysen von Myelinkomponenten ......................................... 87
5.2 Die intrazelluläre Lokalisierung von PLP in LE/Lys ............................................... 89
5.2.1 Die Funktion von LE/Lys als Membranspeicher __________________________ 89
5.2.2 Findet Ca2+-abhängige Exozytose von PLP enthaltenden LE/Lys statt? ________ 91
5.3 Myelinproteine werden endosomal sortiert ....................................................... 93
5.4 Die Rolle von endosomalem Recycling bei der Bildung der Myelindomänen ....... 96
6 Zusammenfassung .................................................................................................. 100
Inhaltsverzeichnis
7 Referenzen ............................................................................................................. 101
8 Anhang .................................................................................................................. 111
8.1 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 111
8.2 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................... 115
8.3 Tabellenverzeichnis ......................................................................................... 116
1. Abstract
1 Abstract
Während der Myelinbildung im zentralen Nervensystem (ZNS) umwinden Oligodendrozyten
mit Ausläufern ihrer Plasmamembran mehrfach das Axon. Myelin ermöglicht die
saltatorische Erregungsweiterleitung entlang der Axone und ist zudem für die
Aufrechterhaltung der axonalen Integrität erforderlich (Edgar and Garbern, 2004). Ein
Oligodendrozyt myelinisiert bis zu 40 Axonsegmente gleichzeitig, wodurch er in seiner
aktivsten Myelinisierungsphase 5 bis 50 x 103 µm2 Membranfläche pro Tag produziert
(Pfeiffer et al., 1993). Die vollständig ausgebildete Myelinscheide besteht aus Subdomänen
mit charakteristischen Protein- und Lipidzusammensetzungen. Die Entwicklung und der
Erhalt der komplexen Myelinmembran erfordert die kontinuierliche Kommunikation
zwischen Neuronen und Glia-Zellen, die Koordination der Protein- und Lipidsynthese sowie
angepasste intrazelluläre Sortier- und Transportwege der Myelinkomponenten. Über die
molekularen Mechanismen, die zur Ausbildung des Myelins und seiner Domänen führen, ist
bisher nicht sehr viel bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Endo- und
Exozytosemechanismen von Myelinproteinen analysiert. Dabei wurden drei Proteine
untersucht, die in unterschiedlichen Subdomänen der Myelinmembran des ZNS lokalisiert
sind. Das Hauptmyelinprotein Proteolipid Protein (PLP), das Myelin-assoziierte Glykoprotein
(MAG) und das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG). Die Exozytose des
Hauptmyelinproteins PLP erfolgt möglicherweise durch sekretorische Lysosomen (Trajkovic
et al., 2006) und ist Ca2+-abhängig. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass PLP,
MAG und MOG unterschiedlichen endosomalen Transportwegen und Sortierprozessen
unterliegen. PLP wird über einen Clathrin-unabhängigen, MAG und MOG hingegen über
einen Clathrin-abhängigen Mechanismus endozytiert. Zudem gelangen die Proteine zu
unterschiedlichen endosomalen Zielkompartimenten und recyceln zu verschiedenen
oligodendroglialen Membrandomänen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die endosomale
Sortierung und das Recycling der Myelinproteine, die für die Bildung der Subdomänen
erforderliche Umgestaltung der oligodendroglialen Plasmamembran unterstützen.
1
2. Einleitung
2 Einleitung
2.1 Oligodendrozyten und das Myelin
Neurone kommunizieren über Depolarisation des "elektrischen Potentials" ihrer Axone.
Diese Potentialänderungen erfolgen energieabhängig, über den Kanal-vermittelten
Austausch von Na+-Ionen und werden in Form von Aktionspotentialen entlang des Axons bis
zu den Synapsen weitergeleitet, wo sie auf benachbarte Neurone übertragen werden. Die
Potentialweiterleitung an unmyelinisierten Axonen erfolgt sehr langsam, mit einer
Geschwindigkeit proportional zum Axonradius. Die schnelle Kommunikation zwischen
unmyelinisierten Neuronen würde daher sehr viel Energie und Platz beanspruchen.
Während der Evolution des komplexen Nervensystems der Vertebraten entstanden
myelinisierende Zellen, die eine schnelle und effiziente Kommunikation zwischen Neuronen
ermöglichen. Die myelinisierenden Zellen des ZNS sind die Oligodendrozyten, die des
peripheren Nervensystems (PNS) die Schwann-Zellen. Sie generieren eine in regelmäßigen
Abständen unterbrochene isolierende Hülle um das Axon, das Myelin. Dabei werden die
myelinfreien Abschnitte als Ranviersche Schnürringe und die myelinisierten Abschnitte als
Internodien bezeichnet (Abb. 2.1).
Myelin besitzt eine geringe Kapazität und einen hohen Widerstand und wirkt
dementsprechend als isolierende Hülle, die den Ionenaustausch während der
Reizweiterleitung verhindert. Der Ionenaustausch erfolgt hingegen an den Ranvierschen
Schnürringen, an denen sich eine Ansammlung von spannungsgesteuerten Na+-Kanälen
befindet. Der Nervenimpuls springt dabei mit einer Geschwindigkeit von bis zu 100 m/s von
Schnürring zu Schnürring, ein Vorgang der als saltatorische Erregungsweiterleitung
bezeichnet wird.

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