Diseño, desarrollo y aplicación de la tecnología LAMP para el diagnóstico de la esquistosomosis

201 Pages·2017·18.79 MB·Spanish

TESIS DO CTORAL
Diseño, desarrollo y aplicac ión de la tecnología LAMP
para el diagnóstico de la esquistosomosis: del
laboratorio al campo

FACULTAD DE FARMACIA
Departamento de Biología Animal, Parasitología, Ecología,
Edafología y Qu ímica Agrícola
Javier Gandasegui Arahuetes

Julio de 2017
Certificación:
Prof. Dr. Antonio M uro Álvarez, Catedrático de Parasitología del Departamento
de Biología Animal, Parasitología, Ecología, Edafología y Química Agrícola de
la Universidad de Salamanca, y Prof. Dr. Pedro Fernández Soto, Profesor
Contratado Doctor de Parasitología del Departamento de Biología Animal,
Parasitología, Ecología, Edafología y Química Agrícola de la Universidad de
Salamanca.
Certifican:
Que la Tesis Doctoral titulada “Diseño, desarrollo y aplicación de la
tecnología LAMP para el diagnóstico de la esquistosomosis: del
laboratorio al campo”, que se presenta para optar al grado de Doctor por la
Universidad de Salamanca en la modalidad de Tesis por compendio de
publicaciones, ha sido realizada por Javier Gandasegui Arahuetes, Licenciado
en Farmacia por la Universidad Complutense de Madrid, bajo nuestra dirección
en el Departamento de Biología Animal, Parasitología, Ecología, Edafología y
Química Agrícola de la Universidad de Salamanca y en el Centro de
Investigación de Enfermedades Tropicales de la Universidad de Salamanca y
dentro del programa de doctorado de Salud y Desarrollo en los Trópicos.
Consideramos que reúne, a nuestro juicio, originalidad y contenidos
suficientes,por lo que autorizamos su presentación para ser evaluada.
Y para que así conste, a efectos legales, expiden el presente certificado en
Salamanca, a 10 de junio de 2017.

Fdo. Dr. Antonio Muro Álvarez Fdo. Dr. Pedro Fernández Soto
Dedicatoria

A Fernando Gandasegui Alonso, el
Abito, por enseñarme a ser coherente
e íntegro, por tu imborrable ejemplo

Nada te turbe,
Nada te espante,
Todo se pasa, [...]
Santa Teresa de Jesús
Agradecimientos
A mis directores, Antonio Muro Álvarez y Pedro Fernández Soto, por darme la
oportunidad de comenzar mi carrera como investigador, por concederme
libertad para trabajar, por la dedicación y el tiempo invertido para que esta
tesis doctoral saliera adelante y por no desesperarse más de la cuenta. Muchas
gracias.
Mi más profundo y sincero agradecimiento se lo dedico a mis padres, Fernando
y Marta. En el contexto actual de este país en el que la investigación ni se valora
ni se reconoce, mis padres, como muchos otros padres, se han convertido en el
principal sustento de muchos jóvenes investigadores. Gracias por apoyarme
personal y económicamente estos años. Si esta tesis doctoral ha alcanzado
un cierto grado de calidad ha sido gracias a vosotros y vuestro esfuerzo.
Gracias por permitirme invertir todo mi tiempo en la ciencia. Por todo,
desde lo más hondo y con el corazón en la mano, gracias.
A mis compañeros y a todas las personas que han trabajado conmigo estos
largos años. Gracias a Juan, Ana, Carmen y Julio, por todo lo compartido. A
Belén, gracias por tu alegría y tu sabio consejo, sin ti todo habría sido un poco
más difícil. A mi gran amigo Edward, el entusiasta, el diestro, el gran científico
al que la propia ciencia no ha dejado ejercer. Gracias por mantener el ánimo,
por tu insaciable curiosidad y por darme confianza y energía. A todos, muchas
gracias.
Quiero dar las gracias a las hermanas teresianas de la Misión Católica de Cubal,
a Fabio y a Elainne, y a todos los trabajadores, “mulungus” y “mulandes”, del
Centro de Investigação em Saúde de Manhiça. Gracias por abrirme las puertas
de vuestras casas. Quien soy ahora os lo debo en parte a vosotros.
A mi amigo Rubén Herrero Valverde, por ser ese diseñador que muchos
investigadores necesitamos. Gracias por embellecer este trabajo.
Por último, si echo la vista atrás y me fijo en las últimas semanas, debo dar las
gracias a Mati y Sebas. Gracias por tener la trapa levantada, un gesto amable y
unas palabras. Sin vosotros, estos últimos días hubiesen sido aún más
complicados.
A todos y todas, ¡Gracias! ¡Obrigado! ¡Uapandula! ¡Kanimambo!
Estamos juntos
Índice
Capítulo I: Introducción
Resumen ....................................................................................................................................................... 1
...................................................................................................................... 3
1.1. Enfermedades olvidadas ............................................................................................................... 5
1.2. Esquistosomosis ............................................................................................................................... 7
1.2.1. Morfología y ciclo biológico ............................................................................................ 8
1.2.2. Genoma, transcriptoma y proteoma ............................................................................ 10
1.2.3. Epidemiología ....................................................................................................................... 12
1.2.4. Patogenia y manifestaciones clínicas .......................................................................... 15
1.2.5. Diagnóstico............................................................................................................................. 19
1.2.5.1. Diagnóstico parasitológico .............................................................................. 19
1.2.5.2. Diagnóstico inmunológico ............................................................................... 20
1.2.5.3. Diagnóstico molecular ....................................................................................... 23
1.2.6. Tratamiento y control........................................................................................................ 25
point-of-care
1.3. LAMP: mecanismo, utilidad y aplicabilidad........................................................................... 27
1.3.1. Aplicación del LAMP como diagnóstico .......................................... 31
1.3.2. LAMP y helmintos ............................................................................................................... 34
Capítulo II: Hipótesis y objetivos
1.4. Bibliografía .......................................................................................................................................... 42
................................................................................................... 58
2.1. Hipótesis de trabajo ........................................................................................................................ 59
Capítulo III: Artículos de investigación
2.2. Objetivos .............................................................................................................................................. 59
A Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for early
...................................................................................... 60
detection of Schistosoma mansoni in Stool Samples: A diagnostic approach in a
3.1. Artículo 1:
murine model
The Rapid-Heat LAMPellet Method: A potential diagnostic method for
.............................................................................................................................................. 61
human urogenital schistosomiasis.
3.2. Artículo 2:
Biompha-LAMP: A new rapid loop-mediated isothermal amplification
..................................................................................................... 73
assay for detecting Schistosoma mansoni in Biomphalaria glabrata snail host.
3.3. Artículo 3:
Field and laboratory comparative evaluation of a LAMP assay for
............... 97
diagnosis of urogenital schistosomiasis in Cubal, Central Angola.
3.4. Artículo 4:
A field survey using LAMP assay for detection of Schistosoma mansoni
.......................................... 112
in a low-transmission area of schistosomiasis in Umbuzeiro, Brazil: assessment in
3.5. Artículo 5:
human and snail samples
Capítulo IV: Conclusiones
. ....................................................................................................................... 133
Anexo metodológico
.................................................................................................................. 152
............................................................................................................................. 155
primers
1. Procesamiento de la muestra y extracción de ADN ............................................................... 156
S. mansoni
2. Selección de secuencias y diseño de ............................................................................ 161
S. haematobium ..............................................................
3. Amplificación de ADN de : SmMIT-LAMP ............................................................. 168
S. mansoni Biomphalaria
4. Amplificación de ADN de : Sh-LAMP 170
Apéndice
5. Amplificación de ADN de en spp.: Biompha-LAMP ............. 172
..................................................................................................................................................... 173
1. Otros artículos de investigación .................................................................................................... 174
2. Trabajos presentados en congresos ............................................................................................. 176
3. Estancias en el extranjero ................................................................................................................. 186
4. Premios de investigación .................................................................................................................. 190
Resumen

Resumen
Schistosoma
La esquistosomosis, una enfermedad parasitaria producida por trematodos
del género , es una de las principales enfermedades tropicales
desantendidas. En la actualidad no se dispone de un método de diagnóstico
adecuado ya que las técnicas parasitológicas y serológicas presentan problemas de
loop-
sensibilidad y especificidad. El diagnóstico molecular no se utiliza de forma
mediated isothermal amplification
rutinaria, particularmente en zonas endémicas y de bajos recursos. El LAMP (
) es una técnica de amplificación de ADN que se
realiza en condiciones isotérmicas. Presenta las ventajas de ser rápida, sensible,
point-of-care
específica, permite la discriminación visual de los resultados y puede ser aplicada
como diagnóstico . En este trabajo se diseñaron, desarrollaron y
Schistosoma mansoni Schistosoma haematobium
aplicaron métodos moleculares basados en la tecnología LAMP para el diagnóstico
S. mansoni
de y , así como para la detección de
caracoles infectados con . S.
mansoni
En primer lugar, se desarrolló una técnica de amplificación de ADN de
, denominada SmMIT-LAMP, que ha mostrado su efectividad para la
detección del parásito en la fase aguda de la infección. Su aplicación en muestras
humanas y de caracoles en un área endémica de baja transmisión en Brasil ha
demostrado una alta sensibilidad en comparación con las técnicas de diagnóstico
clásicas, así como su utilidad para la identificación de focos de transmisión de la
enfermedad. Estos estudios se detallan en los trabajos 1 y 5.
S. haematobium.
A continuación se diseñó otro método LAMP (Sh-LAMP) para la detección
de Se puso a punto en muestras clínicas de orina en el laboratorio
con y sin extracción previa de ADN (Rapid-Heat LAMPellet method) y
posteriormente se evaluó con éxito en una zona de alta transmisión en Angola.
Además, Sh-LAMP mostró una elevada reproducibilidad en un laboratorio de
referencia. Estos estudios se encuentran recogidos en los trabajos 2 y 4.
S. mansoni
Finalmente, Biompha-LAMP mostró ser una herramienta útil para la
detección de en caracoles infectados experimentalmente. Este estudio
se encuentra detallado en el trabajo 3.

1
Resumen

Resumo
Esquistossomose, uma doença parasitária causada por trematódeos do
gênero Schistosoma, é uma das principais doenças tropicais desantendidas.
Atualmente não há um método diagnóstico adequado, como técnicas parasitológicas
e sorológicas têm problemas de sensibilidade e especificidade. O diagnóstico
molecular não é rotineiramente utilizada, particularmente em áreas endémicas e
pobre. A técnica LAMP é uma amplificação de ADN é realizada sob condições
isotérmicas. Tem as vantagens de ser rápida, sensível, específica, permite que os
resultados de discriminação visual e pode ser aplicada como um diagnóstico point-of-
care. Neste trabalho foram concebidos, desenvolvidos e aplicados métodos
moleculares baseados na tecnologia LAMP para o diagnóstico de Schistosoma
mansoni e Schistosoma haematobium, e para detectar caracóis infectados com S.
mansoni.
Em primeiro lugar, uma técnica foi desenvolvida para a amplificação de ADN
de S. mansoni, chamada SmMIT-LAMP, o qual provou ser eficaz para a detecção do
parasita na fase aguda da infecção. A sua aplicação em amostras humanas e de
caracois numa área endémica de baixa transmissão no Brasil tem mostrado alta
sensibilidade em relação às técnicas convencionais de diagnóstico e sua utilidade
para identificar focos de transmissão da doença. Estes estudos são detalhados no
trabalho 1 e 5.
Em seguida, outro método LAMP (Sh-LAMP) para a detecção de S.
haematobium foi concebido. Ele foi otimizado em amostras clínicas de urina no
laboratório com e sem extracção de ADN (Rapid-Heat LAMPellet method) e,
subsequentemente, avaliadas com sucesso numa zona de transmissão em Angola.
Além disso, Sh-LAMP mostrou elevada reprodutibilidade no laboratório de
referência. Estes estudos são recolhidos no trabalho 2 e 4.
Finalmente, Biompha-LAMP mostrou-se útil para a detecção de S. mansoni em
caracóis infectados experimentalmente. Este estudo é o trabalho detalhado 3.

2
3
Capítulo I: Introducción

El tema principal de este trabajo es el desarrollo de nuevos métodos de
diagnostico molecular aplicables en zona endémica de esquistosomosis, una de las
enfermedades tropicales olvidadas más importantes. Por este motivo, el primer
enfermedades
apartado de la introducción de esta tesis doctoral comenzará explicando
olvidadas
brevemente el concepto y las principales características de las
. Se enumerarán los patógenos que producen estas infecciones y
daremos una visión global sobre el impacto que provocan en la salud.
esquistosomosis
Dado que la enfermedad objeto de estudio de este trabajo es la
, a continuación se describirá el parásito causante de la
enfermedad, prestando atención a sus características morfológicas, su genoma,
ciclo de vida y epidemiología, así como la patogenia y las manifestaciones clínicas.
Se hará especial hincapié en los métodos de diagnóstico más habituales y los más
innovadores, mostrando la necesidad del desarrollo de nuevas técnicas.
Finalmente, se comentará brevemente las pautas terapéuticas y las medidas
Schistosoma mansoni Schistosoma haematobium
preventivas frente a la esquistosomosis. En este apartado nos centraremos
especialmente en y , ya que son las
dos especies de estudio en esta tesis doctoral.
amplificación de ADN mediante LAMP loop-mediated isothermal amplification
Puesto que la técnica de diagnóstico desarrollada y evaluada es la
( ),
en el último apartado se explicará con detalle el mecanismo, las principales
características de la técnica, su utilización para la detección de diferentes
point-of-care
enfermedades producidas por helmintos y su potencial aplicación como test de
diagnóstico

4
Capítulo I: Introducción
1.1. Enfermedades olvidadas
Neglected Tropical Diseases
El grupo de las enfermedades olvidadas, o como indican sus siglas en inglés
(NTDs), son un grupo heterogéneo de enfermedades
transmisibles presentes en 149 países de las regiones tropicales y subtropicales
del planeta. Son enfermedades fuertemente relacionadas con la pobreza que
afectan mayoritariamente a las poblaciones más pobres y excluidas de la sociedad
(WHO, 2017). Tras la Declaración del Milenio en el año 2000 empezó a gestarse el
“Neglected Tropical Disease
concepto de enfermedades olvidadas, pero no fue hasta 2005 cuando aparece por
PLOS Medicine
primera vez el término ” en un artículo publicado en la
revista (Molyneux et al., 2005). En principio fueron trece las
enfermedades consideradas como NTDs (Hotez et al., 2006). Posteriormente, la
Organización Mundial de la Salud (OMS) incluye cuatro más. (WHO, 2010).
Recientemente se han añadido ectoparásitos, micosis profundas y envenenamiento
por mordedura de serpiente, resultando un total de 20 las entidades incluidas
como enfermedades olvidadas (Tabla 1).
•L as características generales de las NTDs son (Hotez, 2011):
Enfermedades que afectan especialmente a la población que vive bajo el umbral
de la pobreza, particularmente en países del África Subsahariana, Asia,
• Latinoamérica y el Caribe (aproximadamente 1.400 millones de personas).
Son de curso crónico, produciendo desajustes que dan como resultado
problemas en el crecimiento infantil, en el desarrollo cognitivo, durante el
• embarazo o disminución de la capacidad de trabajo.
A pesar de mostrar una elevada morbilidad, la mayoría de las NTDs se
• caracterizan por presentar una mortalidad relativamente baja.
La mayoría de las NTDs son enfermedades que se conocen desde hace miles de
años y están recogidas en diferentes textos antiguos (por ejemplo, la hematuria

producida por la esquistosomosis urogenital se recoge en el papiro de Ebers en
el año 1500 a.C. (Kloos y D avid, 2002).

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