Diagnóstico de paludismo por Plasmodium Vivax utilizando secuencias repetitivas de ADN ...

258 Pages·2012·3.68 MB·Spanish

Tesis de Posgrado
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PPllaassmmooddiiuumm VViivvaaxx uuttiilliizzaannddoo
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Carnevale, Silvana
2002
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias
Biológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca
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Cita tipo APA:
Carnevale, Silvana. (2002). Diagnóstico de paludismo por Plasmodium Vivax utilizando
secuencias repetitivas de ADN parasitario. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires.
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Cita tipo Chicago:
Carnevale, Silvana. "Diagnóstico de paludismo por Plasmodium Vivax utilizando secuencias
repetitivas de ADN parasitario". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.
Universidad de Buenos Aires. 2002.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3490_Carnevale.pdf
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Diagnóstico de Paludismo por
Plasmodium vívax utilizando
secuencias repetitivas de
ADN parasitario
Lic. Silvana Carnevale
TESIS PARAOPTAR AL TÍTULO DE DOCTOR
DE LA UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Director: Dr.Sergio OscarAngel
BuenosAires,Argentina
Agosto de 2002
Jim-en­
Resumen
La malaria es unproblema de salud pública mundial en másde 100paises habitados por
un total de 2.400 millones de personas, representando el 40% de la población mundial. Las
cuatro especies más comunes que infectan al hombre son:Plasmoa'ium vivax,P.falciparum, P.
malariae yP. ovale, de las cuales, las dos primeras, representan el 95% de las infecciones. En
Argentina se plantea la necesidad de trabajar sobre P. vr'vax,pues no se han registrado casos
autóctonos depaludismoporP.falciparum.
El propósito de este estudio fue disponer de herramientas moleculares para la detección
de P. vivax, aplicables a muestras humanas y vectores, adaptables a las condiciones de
recolección y procesamiento básico disponibles en lasbases operativas del Programa Nacional
de Paludismo. Para ello se obtuvieron y caracterizaron secuencias repetitivas de ADN de P.
vivax. El fragmento clonado (instlO) resultó en un tamaño de 6.899 pb y presentó varias
repeticiones directas en tandem y un elemento repetitivo del tipo disperso. Este fragmento
incluyó la secuencia específica de P. vivax, instlO-ll, de 75 pb, que fue empleada como
sonda en el desarrollo de la técnica de Dot blot, y la secuencia instE/C, dentro de la cual se
diseñó el blanco de reacción de PCR.
Desde el punto de vista del diagnóstico individual, las técnicas de PCR-sangre e
instlO-l l-Dot blot demostraronservaliosaspara emplearsecomo métodosen el diagnóstico
de pacientes sintomáticos y asintomáticos, incluyendo aquellos que retoman de una zona
endémica de infecciones causadas por P. vr'vax,ypara el seguimiento de pacientes.
Desde la perspectiva epidemiológica la técnica de PCR-elutorios desarrollada en este
trabajo permitió efectuar el diagnóstico específico de la especie P. vivax en pacientes
sintomáticos y asintomáticos, lo que facilitaría su uso en acciones de detección por búsqueda
pasiva y activa. Por otro lado, el método de PCR aplicado a vectores mostró ser una de las
pocas alternativas disponibles de alta sensibilidad y especificidad para la detección de P. vivax
en mosquitos experimental y naturalmente infectados, con condiciones prácticas de
conservación de muestras. Las técnicas desarrolladas en este trabajo son de utilidad para el
manejo debrotes yepidemias yacontribuyen a ladetección del aumento de la tasa de infección
en mosquitos, al estudio de las migraciones y la vigilancia de la quimiorresistencia. El trabajo
realizado se enmarca como un desarrollo local de herramientas diagnósticas aplicables al
control del paludismo en Argentina.
Palabras claves: paludismo, Plasmodium vivax, diagnóstico, vigilancia, control de vectores,
manejo clínico, secuencias de ADN repetitivas
Abstract
Malaria is a public health problem in more than one hundred countries, meaning that
40% (2,400 million) of the world’s total population is exposed to malaria n'sk. The four
common species that infect humans are Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P.
ovaIe, and the two first ones represent 95% of infections. In Argentina it is necessary to work
onP. vivax,because there are not localcases of malaria due toP.falciparum.
The purposeofthis studywasto have disposal of molecular tools forthe detection of P.
vivax, that could be applied to human and mosquito samples, and adapted to the basic
conditions of collection and processing available at the operating settings of the National
Malaria Programme. Inthis way we obtained and characterized repetitive sequences ofP. vivax
DNA. The cloned fragment (instlO) resulted in a molecular size of 6,899 bp, with several
tandem direct repeats and a repetitive interspersed element. This fragment included the
instlO-ll P. vivax-specificsequence(75 bp), employedas probe for the development of the
Dotblottechnique,andthe instE/C sequence,insidewhichthe PCRtarget wasdesigned.
At the individual level, the PCR-blood and instlO-l l-Dot blot demonstrated to be
valuable methods for the diagnosis of symptomatic and asymptomatic patients, including those
retuming fromP. vr'vaxendemic areas, and for management of cases.
Atthe epidemiological level,the technique of PCR-blood impregnated filter paper disks
developed in this work allowed the specific diagnosis of P. vivax in symptomatic and
asymptomatic patients. This fact could facilitate its use in active and passive surveillance. The
PCRmethodologyapplied to malaria vectors showedto be oneofthe fewavailable altematives
of high sensitivity and specificity for the detection of P. vivaxin experimentally and naturally
infected mosquitoes, with practical conditions for sample storage. The techniques developed in
this work are useful for management of outbreaks and epidemics, as they contribute to the
detection of increased infection ratios in mosquitoes, to the study of migrations, and to the
surveillance of drug resistance. This work can be described as a local development of
diagnostic tools that can be applied to malaria control inArgentina.
Key words: malaria, Plasmodium vivax, diagnosis, surveillance, vector control, clinical
management, repetitive sequences of DNA.
A mi mamá
AJorge
—Agradecimientos ­
Agradecimientos
Al Dr. Hernando del Portillo, del Instituto de Ciencias Biomédicas IIde la Universidad
de Sao Paulo, por su contribución en la provisión de genotecas, plásmidos, filtros, y por sus
aportes en eldiseño deexperimentos e interpretación de resultados.
Al Dr. Jorge Velásquez, del Hospital Municipal de Infecciosas “Dr. Francisco J.
Muñiz”, por su valiosa colaboración en la interpretación clínica de resultados, discusión y
redacción deeste trabajo y suconstante incentivo.
Al Dr. Sergio Angel, investigador del CONICET, por sus valiosos aportes en todos los
estudios moleculares.
Al Dr. Eduardo Guamera, jefe del Departamento de Parasitología del INEI, ANLIS
“Dr. Carlos G. Malbrán”, por darme la posibilidad de realizar esta Tesis en mi lugar de trabajo
y por ayudarme en lacolección de muestras enáreas endémicas.
A los Dres. Rolando Boffi y Roberto Chuit, que en 1994-1995, desde la Dirección de
Epidemiología del Ministerio de Salud, me facilitaron los medios para la recolección de
muestras en elNoroeste Argentino.
Al Dr. Enrique Bellegarde, del Hospital Municipal de Infecciosas Francisco J.
Muñiz”, por su esfuerzo en la provisión de muestras ydatos de loscontroles utilizados.
Al Dr. Mario Zaidenberg,jefe del Programa Nacional de Paludismo, por la información
brindada sobre losantecedentes yactual situación del paludismo en laArgentina.
Al Dr. Néstor Taranto, del Hospital San Vicente de Paul de Orán, por su atención,
esfuerzos y facilidades de laboratorio que recibiera durante mis tareas en dicha ciudad.
Al Dr. Nicanor Sosa, que en 1994 se desempeñara como director del Hospital de
Yrigoyen, por sucooperación en labúsqueda decasos en lazona fronteriza yen Bermejo.
Al Dr. Nicolás Schweigmann, por la provisión de muestras controles negativas de
mosquitos ypor colección demuestras enterreno.
Al Dr.Raúl Franco, por su colaboración en eldesarrollo de lastécnicas moleculares.
A todo el personal del Programa Nacional de Paludismo, particularmente a quienes se
desempeñan y desempeñaron en la Base Operativa de Orán, por su apoyo constante en la
obtención de muestras humanas yde mosquitos, incluyendo suclasificación taxonómica.
-Agradecimientos­
A los Vianconi, padre e hijo, de la Base Operativa de Orán, por facilitarme las
condiciones para eltrabajo en terreno.
A losagentes sanitarios de APS Salta, por su participación en la identificación de casos.
A los pacientes del NOA, por recibirrne en sus hogares.
Al Dr. José Bento, del Instituto Militar de Río de Janeiro, por su contribución en
muestras controles positivas de mosquitos.
Al Dr. Claudio Ribeiro, de FIOCRUZ, por sus sugerencias y aportes sobre técnicas
moleculares.
A la Dra. Regina Amendoeira, del Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, por su constante
incentivo a la realización de este trabajo ypor sus innumerables contribuciones.
Al Dr. Líen Kuo, por la realización de diapositivas de muestras dePlasmodium.
A mis compañeros del Departamento, por sus diferentes contribuciones en la ejecución
de este trabajo.
A Marta Cabrera, por su incansable ayuda en todas las actividades de laboratorio de
esta tesis, ypor sus valiosos aportes en el diagnóstico etiológico de paludismo.
A Jorge Labbé, por su participación desde el inicio en la labor experimental y las
discusiones técnicas.
A Mónica Rodríguez, por sus aportes en la observación microscópica y la realización
de extracciones de ADN de mosquitos.
A Marcela Ferella, Octavio Fusco y Juan Manuel Centeno, por su participación en la
secuenciación automática de fragmentos de ADN.
Ya mi mamá, portodo su cariño e incentivo en larealización de esta Tesis.
-Publicach ­
Publicaciones
Velásquez JN, Camevale S,Guamera EA, Labbé JH, Chertcoff A,Cabrera MG, Rodríguez
MI. 1996. Detection of the microsporidian parasite Enterocytozoon bieneusi in
specimens from patients with AIDS by PCR. Journal of Clinical Microbiology3423230­
3232.
Velásquez JN, Camevale S, Cortí M, dí Rísío C, Bramajo J, Pinto M, Labbé JH, Chencoff
A, CabreraM,RodríguezM,Guamera EA. 1997.Estrategias clásicas para el diagnóstico
de Criptosporidiosis en pacientes con SIDAy diarrea crónica. ActaGastroenterológica
Latinoamericana 27:107-1ll.
Velásquez JN, dí Rísío C, Camevale S, Corti M, Benetuccí J, Bozzíni JP, Cabrera M,
Chertcoff A, Labbé JH, Rodríguez M, Besasso H, Guamera EA. 1997. Estudio
morfológicodeEnterocytozoonbieneusi en pacientes con SIDAy diarrea crónica. Acta
Gastroenterológíca Latinoamericana 27:241-245.
Velásquez JN, Camevale S, Labbé JH, Chertcoff A, Cabrera M, Oelemann W. 1999. In
situ hybridization: a molecular approach for the diagnosis of the microsporidian
parasite Enterocytozoon bieneusi. HumanPathology30:54-58.
Velásquez JN, Camevale S, Bessaso H, Bramajo J, Kuo L, Faimboim H. 2000.
Identicación de Enterocytozoon bleneusi en un paciente con colangitis esclerosante y
SIDA. Acta Gastroenterológica Latinoamericana 30247-51.
Oelemann W, Velásquez JN, Camevale S, Bessaso H, Teixeira MGM, Peralta JM. 2000.
Intestinal Chagas' disease in patients with AIDS.AIDS 14:9-10.
Camevale S, Velásquez JN, Labbé JH, Chencoff A, Cabrera MG, Rodríguez MI. 2000.
DiagnosisofEnterocytozoonbieneusi by PCR in stool samples eluted from filter paper
disks. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 7:504-506.
Velásquez JN, Oelemann W, Camevale S, Bessaso H, Etchait C, Cabrera MG, Pinto ME,
Labbé JH, Kuo LH, Peralta JM. 2000. Trypanosoma cruzí en SIDA: Localización
gastrointestinal y mecanismos alternativos de transmisión. Revista del Hospital
Nacional Baldomero Sommer 327-18.
-Publicacions­
Camevale S, Rodríguez M, Santillán G, Labbé J, Cabrera M, Bellegarde E, Velásquez J,
Trgovcic J, Guamera E. 2001. Immunodiagnosis of human fascioliasis by an enzyme­
linked immunosorbent assay (ELISA) and a Micro-ELISA. Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology 8:174-l77.
Camevale S, Rodriguez MI, Guamera EA, Carmona C, Tanos T, Angel S. 2001.
Immunodiagnosis of fasciolosisusing recombinant procathepsin L cystein proteinase.
Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases 41:43-49
Velásquez JN, Camevale S, Mariano M, Kuo LH, Caballero A, Chertcoff A, Ibáñez C,
Bozzini JP. 2001. Isosporosis and unizoite tissue cysts in patients with acquired
immune deficiency syndrome. HumanPathology32:500-505.
-Participaciones oficiales­
Participaciones oficiales
I Participación en la Comisión Asesora encargada de la normatización del área Parasitosis,
por citación de laDirección de Programas y Servicios de Atención de la Salud en uso de las
facultades que leotorga el Art. 5de la Resolución Ministerial N°411/99. l999-actual.
I Participación en la elaboración de la Guía de Prevención, Procedimiento, Diagnóstico y
Tratamiento en Parasitosis (Resolución 898/2001 del Ministerio de Salud), para el
Programa Nacional de Garantía de la Atención Médica del Ministerio de Salud de la
Nación. Publicada en Boletin Oficial de la República Argentina N° 29734, 18/09/2001,
Suplemento.