Développement de méthodes de référence pour les biomarqueurs du bilan lipidique

229 Pages·2014·8.71 MB·French

UNIVERSITE DE BOURGOGNE

Unité LNC-Lipides Nutrition Cancer – INSERM UMR 866
Université de Bourgogne

Département « Biomédical et Chimique Organique »
Laboratoire national de métrologie et d’essais
1 rue Gaston Boissier – 75724 Paris Cedex 15

THESE
Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Bourgogne
Discipline : Sciences Vie

Par
Maud HEUILLET

Le 13 décembre 2013

Développement de méthodes de référence pour
les biomarqueurs du bilan lipidique :
Application au contrôle qualité en biologie

clinique

Directeur de thèse :
Pr. Laurence DUVILLARD

Co-encadrant de thèse :
Dr. Vincent DELATOUR

Jury :
Pr. Philippe GAMBERT Président du jury
Pr. Dominique BONNEFONT-ROUSSELOT Rapporteur
Pr. Nader RIFAI Rapporteur
Dr. Ingrid ZEGERS Examinateur
Pr. Philippe GILLERY Examinateur
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A ma famille,
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Remerciements

Ces travaux de thèse n’auraient jamais pu voir le jour sans l’aide de nombreuses personnes que je
souhaite tout particulièrement remercier.

Tout d’abord, je tiens à remercier ma directrice de thèse Laurence Duvillard pour son soutien et
ses conseils durant ces trois années de thèse ainsi que sa grande disponibilité malgré la distance
qui sépare Paris à Dijon.
Je voudrais également remercier Vincent Delatour, mon co-encadrant au sein du LNE, pour son
aide précieuse et sa confiance qui m’ont permis de progresser tout au long de cette thèse et
d’arriver au terme de ces travaux. Je n’oublierai pas nos grandes discussions qui apportaient de
nombreuses réponses et pleins d’autres questions et qui faisaient également une envieuse de
l’équipe de chimie inorganique que je n’oserai pas citer.
Merci à Béatrice Lalere et Sophie Vaslin-Reimann pour m’avoir offert la chance de travailler au
LNE et pour leur implication dans mon projet de thèse.

Je remercie également les membres du jury, d’avoir eu la gentillesse de lire et d’évaluer mon

travail de thèse.

Un grand merci à tous mes collègues au LNE pour leur accueil chaleureux et leur soutien, et plus
particulièrement aux piliers de la chimie organique et inorganique Véronique Lediouron et Caroline
Oster. Mon expatriation en terre Parisienne n’aurait pas été aussi facile sans vous.
Je n’oublie pas mon co-thésard Vincent Brieudes pour sa patience au quotidien et nos nombreux
fous rires, Anaïs Rincel et Anne-Lise Borlot pour nos grandes discussions autour d’un café et bien
évidemment Maryline Peignaux responsable de la plateforme analytique, qui m’a tout appris et
sans qui je ne serai pas là aujourd’hui.
Je tiens également à remercier Jean-Paul Pais de Barros et Anne Athias de m’avoir si bien
accueilli au sein de la plateforme de lipidomique de Dijon et pour leurs précieux conseils. J’ai
beaucoup appris sur l’analyse des lipoprotéines grâce à vous.

Je remercie enfin mes meilleurs amis Stéphanie et Kevin ainsi que mes parents et toute ma famille,
qui m’ont toujours soutenu et leur réconforté dans les moments difficiles.
Je voudrais simplement terminer en remerciant Julien pour son soutien sans faille. Ca n’a pas du
être tous les jours facile de me supporter, surtout durant les dernières semaines.
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Résumé

En biologie clinique, il est indispensable de disposer de mesures fiables et comparables dans le
temps et entre les laboratoires afin de permettre un dépistage et un suivi appropriés des patients.
Pour cela, il est indispensable d’établir leur traçabilité métrologique aux unités du système
international notamment par des méthodes de référence primaires ou des matériaux de référence
certifiés (MRC) d’ordre supérieur.
Ces travaux de thèse ont consisté à développer et valider des méthodes de référence pour le
cholestérol total, les triglycérides, le HDL-cholestérol et le LDL-cholestérol. Leur valeur ajoutée par
rapport à une valeur consensuelle a été démontrée lors d’évaluations externes de la qualité. Elles
ont également permis de certifier un MRC qui pourra être utilisé pour le contrôle qualité et/ou
l’étalonnage des méthodes de routine. Nous avons montré que le MRC était commutable pour la
plupart des méthodes de routine pour les différents biomarqueurs, ce qui a permis de l’utiliser pour
évaluer leur justesse. Les méthodes de routine avaient généralement tendance à sous-estimer la
concentration en triglycérides (en particulier aux valeurs basses) et à surestimer nettement la
concentration de cholestérol total et de LDL-cholestérol (en particulier aux concentrations proches
du seuil de décision clinique), ce qui se traduit par une augmentation du nombre de faux-positifs
(patients traités à tort). Une approche de correction de non commutabilité a également été
proposée afin de permettre l’utilisation de matériaux non commutables pour évaluer la justesse.
Pour conclure, ces travaux ont démontré l’importance de disposer de méthodes de référence ainsi
que de MRC commutables.

Mots clés :
Méthodes de référence, Matériaux de Référence Certifiés, Cholestérol, Triglycérides, Evaluation
externe de la qualité, Traçabilité métrologique, Laboratoires de biologie médicale, Commutabilité,
Spectrométrie de masse.

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Abstract

Reliable measurements in medical biology are essential for early screening and appropriate follow-
up of patients. Ensuring metrological traceability of clinical measurements to higher order reference
methods or certified reference materials enables to obtain comparable results over time and
between different laboratories that could use different methods to quantify the same biomarker.
In this study, reference methods were developed and validated for lipid profile biomarkers (total
cholesterol, triglycerides, HDL-C, and LDL-C). Their value added in proficiency testing schemes
was demonstrated against consensus mean. They were also used to characterize a certified
reference material (CRM) that may be used both as quality control and/or calibrator of field
methods. The CRM was shown to be commutable for most field methods and lipid profile
biomarkers, which proved it was suitable to assess trueness. Results of our multicenter study
showed that field methods tend to underestimate triglycerides (particularly at low concentrations)
and overestimate total cholesterol and LDL-C (especially around the clinical threshold), resulting in
false positives and significant patient misclassifications. An approach of non-commutanility
correction was also presented to allow trueness assessment with non-commutable samples. In
conclusion, this work highlights the importance of using reference methods and also commutable
CRM to rigorously assess accuracy of field methods used in clinical laboratories.

Keywords:
Reference methods, Certified Reference Materials, Cholesterol, Triglycerides, Proficiency testing
schemes, Metrological traceability, Clinical Laboratories, Commutability, Mass spectrometry.
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Table des matières

INTRODUCTION ............................................................................................................... 15
Partie A - ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................... 19
I. Assurance qualité en biologie médicale ................................................................. 21
1. Enjeux relatifs à la fiabilité des analyses médicales ........................................... 21
2. Organisation des contrôles de qualité en France ................................................ 22
2.1. Accréditation des laboratoires de biologie médicale ............................................. 22
2.2. Contrôles internes et contrôles externes de la qualité .......................................... 24
2.2.1. Les contrôles internes de la qualité (CIQ) ................................................................. 24
2.2.2. Les évaluations externes de la qualité (EEQ) ............................................................ 26
2.2.3. Evaluation des incertitudes de mesure ...................................................................... 27
3. Valeur ajoutée de la métrologie en biologie médicale ........................................ 29
3.1. Traçabilité ............................................................................................................. 29
3.2. Méthodes de référence et matériaux de référence certifiés .................................. 30
3.3. Commutabilité ....................................................................................................... 32
3.3.1. Définition de la commutabilité ................................................................................... 32
3.3.2. Comment évaluer la commutabilité d’un matériau ? .................................................. 33
3.3.3. La correction des effets de matrice ........................................................................... 35
3.4. Impact économique .............................................................................................. 36
II. Les lipoprotéines ...................................................................................................... 37
1. Structure des lipoprotéines ................................................................................... 37
2. Métabolisme des lipoprotéines ............................................................................. 39
2.1. Les Chylomicrons ................................................................................................. 41
2.2. La cascade VLDL-IDL-LDL ................................................................................... 41
2.3. Les HDL ................................................................................................................ 42
3. Lipoprotéines et athérosclérose ........................................................................... 43
3.1. Epidémiologie ....................................................................................................... 43
3.1.1. Définition et prévalence des dyslipidémies ................................................................ 43
3.1.2. Dyslipidémies et risque cardiovasculaire ................................................................... 45
3.1.3. Etudes d’intervention ................................................................................................. 47
3.2. Mécanisme de l’athérosclérose ............................................................................ 48
3.2.1. Rôle athérogène des lipoprotéines de faible densité ................................................. 49
3.2.2. Rôle protecteur des HDL ........................................................................................... 51
3.3. Traitement et seuils thérapeutiques ...................................................................... 52
III. Méthodes de dosage pour les biomarqueurs du bilan lipidique .......................... 53
1. Méthodes de dosage du cholestérol total ............................................................ 53
1.1. Méthodes de dosage utilisées par les laboratoires de biologie médicale.............. 54
1.1.1. Méthodes utilisant un chromogène phénolique ......................................................... 54
1.1.2. Méthodes utilisant un chromogène non phénolique................................................... 55
1.1.3. Interférences ............................................................................................................. 57
1.2. Méthodes de référence ......................................................................................... 58
1.2.1. Méthode de référence par spectrophotométrie .......................................................... 58
1.2.2. Méthodes de référence par dilution isotopique .......................................................... 60
2. Méthodes de dosage du LDL-cholestérol ............................................................ 66
2.1. Méthodes utilisées par les laboratoires de biologie médicale ............................... 66
2.1.1. Calcul du LDL-cholestérol par l’équation de Friedewald ............................................ 67
- 8 -
2.1.2. Les méthodes dites « directes » ................................................................................ 68
2.2. Méthode de référence : la β-quantification ............................................................ 77
3. Méthodes de dosage du HDL-cholestérol ............................................................ 79
3.1. Méthodes utilisées par les laboratoires de biologie médicale ............................... 80
3.1.1. Techniques de précipitation sélective des lipoprotéines ............................................ 80
3.1.2. Méthodes homogènes ............................................................................................... 81
3.2. Méthode de référence ........................................................................................... 84
4. Méthodes de dosage des triglycérides ................................................................. 85
4.1. Méthodes de dosage utilisées par les laboratoires de biologie médicale.............. 85
4.2. Méthodes de référence ......................................................................................... 86
IV. Conclusion ................................................................................................................ 88
Partie B- PARTIE EXPERIMENTALE .............................................................................. 89
I. Caractérisation et validation des méthodes de référence..................................... 91
1. Méthode de référence pour le dosage du cholestérol total ................................ 91
1.1. Protocole analytique ............................................................................................. 91
1.1.1. Préparation des échantillons et des étalons .............................................................. 91
1.1.2. Paramètres en GC/MS .............................................................................................. 93
1.2. Evaluation de la justesse et de la fidélité .............................................................. 96
1.3. Estimation des incertitudes ................................................................................... 99
2. Méthode de référence pour le dosage du HDL-C et LDL-C ............................... 102
2.1. Protocole analytique ........................................................................................... 102
2.2. Evaluation de la justesse et de la fidélité ............................................................ 103
2.2.1. HDL-cholestérol ...................................................................................................... 103
2.2.2. LDL-cholestérol ....................................................................................................... 106
2.3. Estimation des incertitudes ................................................................................. 108
3. Méthode de référence pour le dosage des triglycérides ................................... 113
3.1. Protocole analytique ........................................................................................... 113
3.1.1. Préparation des échantillons et des étalons ............................................................ 113
3.1.2. Paramètres GC/MS ................................................................................................. 114
3.2. Evaluation de la justesse et de la fidélité ............................................................ 117
3.3. Estimation des incertitudes ................................................................................. 120
II. Intérêt des méthodes de référence dans les évaluations externes de la qualité123
III. Importance de la commutabilité des matériaux d’étalonnage et de contrôle de
qualité ............................................................................................................................. 133
IV. La correction de non commutabilité : une alternative aux échantillons non
commutables ................................................................................................................. 171
1. Matériels et Méthodes .......................................................................................... 171
1.1. Correction de non commutabilité en un point...................................................... 172
1.2. Correction de non commutabilité par régression linéaire .................................... 173
1.3. Correction de non commutabilité par plage de concentrations ........................... 175
2. Résultats et Discussion ....................................................................................... 175
2.1. Correction de non commutabilité en un point...................................................... 175
2.2. Correction de non commutabilité par régression linéaire .................................... 176
2.3. Correction de non commutabilité par plage de concentration ............................. 178
3. Conclusion ............................................................................................................ 180
V. Développement d’une nouvelle méthode de référence du LDL-cholestérol ..... 181
1. Matériels et Méthodes .......................................................................................... 181
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Purification de lipoprotéines à l’aide de microbilles fonctionnalisées ......................... 181
1.2. Purification de lipoprotéines via la formation de complexes d’anticorps primaires,
secondaires et de PEG .............................................................................................. 182
1.3. Purification de lipoprotéines par colonnes d’affinité ............................................ 183
2. Résultats et Discussion ....................................................................................... 184
2.1. Purification de lipoprotéines à l’aide de microbilles fonctionnalisées .................. 184
2.2. Purification de lipoprotéines via la formation de complexes d’anticorps primaires,
secondaires et de PEG .............................................................................................. 185
2.3. Purification de lipoprotéines par colonnes d’affinité ............................................ 189
3. Conclusion ............................................................................................................ 191
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................ 193
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................ 201
ANNEXES ....................................................................................................................... 215

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