Développement de méthodes d'analyse de l'ADN par clivage d'une chimère ARN/ADN et par ...

346 Pages·2017·5.81 MB·French

by  Florence Mauger

Développement de méthodes d’analyse de l’ADN par
clivage d’une chimère ARN/ADN et par spectrométrie
de masse MALDI-TOF
Florence Mauger
To cite this version:
Florence Mauger. Développement de méthodes d’analyse de l’ADN par clivage d’une chimère
ARN/ADN et par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Génétique. Université Pierre et Marie Curie
- Paris VI, 2012. Français. ￿NNT: 2012PAO66252￿. ￿tel-00833267￿
HAL Id: tel-00833267
https://theses.hal.science/tel-00833267
Submitted on 12 Jun 2013
HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents
entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de
teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires
abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité Chimie Moléculaire ED406
Présentée par
Florence Mauger

Pour obtenir le grade de Docteur de l‘université Pierre et Marie Curie

Développement de méthodes d’analyse de l’ADN
par clivage
d’une chimère ARN/ADN
et par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Soutenue le 10 Juillet 2012 devant le jury composé de :

Mme. Jeanine Tortajada Université EVRY Val d‘Essonne Rapporteur
M. Codjo Hountondji Université Pierre et Marie Curie Rapporteur
M. Christian Rolando Université Lille 1 Examinateur
M. Germain Trugnan Université Pierre et Marie Curie Examinateur
M. Jean-Claude Tabet Université Pierre et Marie Curie Directeur de thèse
M. Ivo Gut CNAG Barcelona co-Directeur de thèse
Remerciements

Remerciements

Ce projet de thèse présenté dans ce mémoire a été réalisé au Laboratoire de Développement et
de Production au sein du CEA/DSV/Institut de Génomique/Centre National de Génotypage. Il
a été effectué sous la direction du Professeur Jean-Claude Tabet, Professeur émérite de
l‘Université Pierre et Marie Curie et du Docteur Ivo Gut, Directeur du Centro Nacional de
Analisis Genomico à Barcelona et responsable du projet READNA.
Je tiens à remercier le Docteur Mark Lathrop, ancien Directeur du CNG, et les membres de la
commission de formation du CEA pour m‘avoir permis d‘effectuer cette thèse dans le cadre
d‘une formation professionnelle. Je tiens plus particulièrement à remercier le Professeur Jean-
Claude Tabet et le Docteur Ivo Gut d‘avoir accepté d‘être mes directeurs de thèse, pour le
temps qu‘ils ont consacré à mes recherches et pour leurs disponibilités.
Je remercie vivement la Professeur Jeanine Tortajada et le Professeur Codjo Hountondji
d‘avoir accepté d‘être rapporteurs ainsi que le Directeur de recherche Christian Rolando et le
Professeur Germain Trugnan d‘avoir bien voulu être examinateurs du jury de cette thèse.
Je tiens également à remercier le Docteur David Gelfang, le Docteur Keith Bauer et le
Docteur Thomas Myers, de la société ROCHE MOLECULAR pour leur collaboration
essentielle concernant le développement des ADN polymérases.
Je remercie également Jérémy Semhoun pour l‘élaboration du logiciel de calcul des masses,
Caroline Horgues, Steven Mcginn, Jorg Tost et Alexandre How Kit pour leur collaboration
sur le projet de l‘analyse de la méthylation de l‘ADN et Ekatherina Darii pour son aide pour
les expériences par ESI-ITMSn. Je tiens également à remercier, Céline Besse, Christian
Daviaud, Céline Lacrouts d‘avoir eu la gentillesse et la patience de corriger mon mémoire.
Enfin, je remercie la Communauté européenne pour le financement de cette étude au sein du
projet READNA 2008-2012.
2
Sommaire

Sommaire
Remerciements 2
Sommaire 3
Abréviation 11
Introduction générale 12
1. Les modifications de l’ADN 13
1.1. L‘ADN 13
1.2. Les modifications de l‘ADN 15
1.2.1. Les modifications de la séquence 15
1.2.2. Les modifications épigénétiques 16
2. Les méthodes d’analyse de l’ADN 17
2.1. Le séquençage de première génération 18
2.1.1. Le séquençage de Sanger 18
2.1.2. Le séquençage de Maxam et Gilbert 20
2.2. Le séquençage de seconde génération 20
2.2.1. Le séquençage sur phase solide 20
2.2.2. Le séquençage par hybridation sur puce 21
2.2.3. Le séquençage cyclique sur puce 22
2.2.4. Le séquençage par microélectrophorèse 23
2.2.5. Le séquençage par nanopore 23
2.3. Le séquençage de nouvelle génération NGS 24
3. Les méthodes d’analyse de l’ADN par spectrométrie de masse 25
3.1. La spectrométrie de masse ESI-IT et MALDI-TOF 25
3.1.1. La spectrométrie de masse ESI-IT 25
3.1.2. La spectrométrie de masse MALDI-TOF 31
3.2. Les méthodes d‘analyse de l‘ADN 42
3.2.1. Les méthodes directes 43
3.2.2. Les méthodes indirectes 45
3
Sommaire

4. Développement de méthodes d’analyse de l’ADN par clivage d’une chimère
ARN/ADN et par spectrométrie de masse MALDI-TOF 47
4.1. Le principe 47
4.1.1. La chimère ARN/ADN 48
4.1.2. Le clivage de la chimère ARN/ADN 49
4.1.3. L‘analyse par MALDI-TOF MS 50
4.2. Les méthodes 51
4.2.1. Les méthodes actuelles 51
4.2.2. Le développement de nouvelles méthodes 53
Chapitre 1. Analyse de la chimère ARN/ADN par spectrométrie de masse en tandem 55
1. Introduction 56
2. Matériels et Méthodes 58
2.1. Matériels 58
2.2. Méthodes 60
2.2.1. Le clivage 60
2.2.2. Le dessalage 60
2.2.3. L‘analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF 60
2.2.4. L‘analyse spectrométrie de masse ESI-IT 61
2.2.5. Les ions fragments 61
3. Résultats 62
3.1. La chimère ARN/ADN 62
3.1.1. La formation de la chimère ARN/ADN 62
3.1.2. La nomenclature des ions fragments 62
3.1.3. Le seuil de détection des chimères ARN/ADN par MALDI-TOF/TOF 63
3.2. L‘analyse des chimères ARN/ADN de 4-mer par MALDI-TOF/TOF 65
3.2.1. Les fragmentations en mode CID des chimères avec une base B (A) 65
4
3.2.2. Les fragmentations en mode CID des chimères avec une base B (C) 69
4
3.2.3. Les fragmentations en mode CID des chimères avec une base B (G) 72
4
3.2.4. Les fragmentations en mode CID des chimères avec une base B (U) 74
4
3.2.5. Le bilan des fragmentations en mode CID 76
4
Sommaire

3.3. Les fragmentations en phase gazeuse de la chimère GCTA 79
3.3.1. L‘impact de la fluence du laser 79
3.3.2. Les fragmentations en mode CID par MALDI-TOF/TOF 83
3.3.3. Les fragmentations en mode CID par ESI-ITMSn 84
3.3.4. Le bilan des fragmentations en mode CID 95
3.4. Les fragmentations en mode CID des chimères ARN/ADN supérieures à 4-mer par
MALDI-TOF/TOF 97
3.4.1. Les fragmentations en mode CID des chimères ARN/ADN de 5-mer 97
3.4.2. Les fragmentations en mode CID des chimères ARN/ADN de 7-mer 102
3.4.3. Les fragmentations en mode CID des chimères ARN/ADN de 10-mer 104
4. Discussion 106
4.1. Les conditions expérimentales 106
4.1.1. La préparation de la chimère ARN/ADN 106
4.1.2. L‘analyse par MALDI-TOF/TOF 107
4.2. Les fragmentations par MALDI-TOF-TOF de la chimère ARN/ADN 109
4.2.1. La détection des ions 109
4.2.2. Les fragmentations en mode CID 110
4.2.3. Le séquençage 114
4.3. Les fragmentations en mode CID de la chimère GCTA 114
4.3.1. L‘analyse par ESI-ITMSn 115
4.3.2. Les ions multichargés 115
4.3.3. Les fragmentations par spectrométrie de masse en tandem 116
5. Conclusion 117
Chapitre 2. Multiplex microhaplotypage par clivage d’une chimère ARN/ADN simple-
brin et par MALDI-TOF MS 120
1. Introduction 121
2. Matériels et Méthodes 123
2.1. Matériels 123
2.2. Méthodes 125
2.2.1. PCR 125
5
Sommaire

2.2.2. L‘élongation linéaire par l‘ADN polymérase G46E CS6R 126
2.2.3. Le clivage 126
2.2.4. Le dessalage 126
2.2.5. L‘analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF 127
3. Résultats 127
3.1. La PCR 128
3.2. La chimère ARN/ADN simple-brin 129
3.3. Le clivage de la chimère ARN/ADN 130
3.4. Le dessalage des fragments de clivage 130
3.5. L‘analyse des spectres de masse MALDI-TOF 130
3.5.1. La matrice HCCA 131
3.5.2. Les paramètres d‘analyse 131
3.5.3. Les microhaplotypes 131
3.5.4. Le microhaplotype ASTW du locus HLA-DRB1-227 132
3.5.5. Les microhaplotypes HCACH du locus HLA-A-98 et MGAR du locus HLA-A-453 134
3.6. L‘analyse des individus 135
4. Discussion 137
4.1. La PCR 137
4.2. La chimère ARN/ADN simple-brin 138
4.2.1. L‘ADN polymérase G46E CS6R 138
4.2.2. Les amorces 138
4.3. L‘analyse des microhaplotypes 139
4.3.1. Le clivage 139
4.3.2. Le dessalage 139
4.3.2. L‘analyse par MALDI-TOF MS 140
4.3.3. Les caractéristiques de la méthode 140
5. Conclusion 141
Chapitre 3. Analyse de la méthylation de l’ADN par clivage d’une chimère ARN/ADN
simple-brin et par MALDI-TOF MS 143
1. Introduction 144
6
Sommaire

2. Matériels et Méthodes 146
2.1. Matériels 146
2.2. Méthodes 148
2.2.1. La conversion au bisulfite 148
2.2.2. Les mélanges d‘ADN 149
2.2.3. La PCR 149
2.2.4. La purification de la PCR 150
2.2.5. L‘élongation linéaire par l‘ADN polymérase KB17 150
2.2.6. Le clivage 151
2.2.7. Le dessalage 151
2.2.8. L‘analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF 151
3. Résultats 153
3.1. Le principe de la méthode 153
3.1.1. La conversion au bisulfite 154
3.1.2. La PCR 154
3.1.3. L‘élongation linéaire par l‘ADN polymérase KB17 155
3.1.4. Les fragments de clivage des CpGs 157
3.1.5. L‘analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF 162
3.1.6. L‘analyse de la méthylation de l‘ADN 162
3.2. L‘analyse du locus CDKN2A-msp1 163
3.2.1. Les fragments de clivage du locus 163
3.2.2. L‘élongation linéaire ATP 166
3.2.3. L‘élongation linéaire GTP 168
3.3. La quantification de la méthylation de l‘ADN 169
3.3.1. La courbe d‘étalonnage du locus CDKN2A-msp1 170
3.3.2. La courbe d‘étalonnage du locus CDKN2A-msp3b 171
3.4. L‘analyse des individus 175
3.4.1. Les loci des gènes CDKN2A et RASSF1A 175
3.4.2. L‘analyse des loci des gènes CDKN2A et RASSF1A 175
7
Sommaire

3.4.3. Le pourcentage de méthylation de l‘ADN des loci CDKN2A-msp1et msp3b 176
4. Discussion 178
4.1. La conversion au bisulfite 179
4.2. La PCR 179
4.2.1. Les amorces 179
4.2.2. Le biais de PCR 179
4.3. L‘analyse de la méthylation de l‘ADN 181
4.3.1. Le re-séquençage 181
4.3.2. L‘analyse des CpGs 182
4.3.3. La quantification de la méthylation de l‘ADN 183
4.4. L‘analyse des individus 186
4.5. L‘avantage de cette méthode 186
5. Conclusion 187
Chapitre 4. Re-séquençage de l’ADN par clivage d’une ribo-PCR et par MALDI-TOF
MS 189
1. Introduction 190
2. Matériels et Méthodes 192
2.1. Matériels 192
2.2. Méthodes 193
2.2.1. La ribo-PCR par l‘ADN polymérase KB17 193
2.2.2. Le clivage 195
2.2.3. Le dessalage 195
2.2.4. L‘analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF 195
3. Résultats 196
3.1. La ribo-PCR par l‘ADN polymérase KB17 197
3.2. Les fragments de clivage 197
3.3. L‘analyse des spectres de masse MALDI-TOF 201
3.3.1. L‘analyse du locus NOS1 201
3.3.2. L‘analyse du locus H19 204
3.3.3. L‘analyse du duplex des loci NOS1 et H19 207
8
Sommaire

3.3.4. L‘analyse du locus SLCO1B1 208
3.4. L‘analyse des individus 210
4. Discussion 213
4.1. L‘ADN polymérase KB17 213
4.1.1. Les propriétés 213
4.1.2. La séquence spécifique d‘amplification 213
4.1.2. Le multiplexage des ribo-PCRs 214
4.2. L‘analyse par MALDI-TOF MS 215
4.2.1. Le mode linéaire 215
4.2.2. L‘étalonnage 215
4.2.3. L‘analyse du double-brin 216
4.2.4. La détection des fragments de clivage 216
4.3. Les avantages de la méthode 217
5. Conclusion 218
Chapitre 5. Multiplex allèle-spécifique génotypage par clivage d’une riboPAP-PCR et
par MALDI-TOF MS 220
1. Introduction 221
2. Matériels et Méthodes 223
2.1. Matériels 223
2.2. Méthodes 225
2.2.1. La riboPAP-PCR par l‘ADN polymérase FP-1 225
2.2.2. Le clivage 226
2.2.3. Le dessalage 226
2.2.4. L‘analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF 226
3. Résultats 227
3.1. Le principe de la méthode 227
3.2. La riboPAP-PCR par l‘ADN polymérase FP-1 229
3.3. Les fragments de clivage 230
3.4. L‘analyse des spectres de masse MALDI-TOF 232
3.4.1. L‘analyse du locus NOS1 232
9