Detektion hormonell aktiver Substanzen im wirkungsrelevanten Konzentrationsbereich zur ...

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Detektion hormonell aktiver Substanzen im
wirkungsrelevanten Konzentrationsbereich zur Beurteilung
einer großtechnischen Abwasser Ozonung

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Vorgelegt von:
Linda Gehrmann
geboren am 14. März 1986
in Duisburg, Deutschland

Greifswald, 2017
Dekan: Prof. Dr. Werner Weitschies

1. Gutachter: Prof. Dr. Frieder Schauer

2. Gutachter: Prof. Dr. Henner Hollert

Tag der Promotion: 18.12.2017
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ...................................................................................................... I
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................ V
Tabellenverzeichnis................................................................................................. IX
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... XI
Abstract ................................................................................................................... XV
Zusammenfassung ............................................................................................... XVII
1. Einleitung ............................................................................................................... 1
1.1 Hormonell aktive Substanzen ........................................................................... 2
1.1.1 Sexualhormone ........................................................................................... 2
1.1.1.1 Östrogene ............................................................................................. 4
1.1.1.2 Androgene ............................................................................................ 5
1.1.2 Endokrine Disruption .................................................................................. 6
1.1.3 Eintrag, Vorkommen und Auswirkungen in der aquatischen Umwelt .......... 8
1.1.4 Bewertung und Grenzwertvorschläge ....................................................... 13
1.2 Analytik von hormonell aktiven Substanzen .................................................... 16
1.2.1 Instrumentelle Analytik .............................................................................. 16
1.2.2 Wirkungsbezogene Analytik...................................................................... 20
1.2.3 Matrixeffekte in Abwässern ....................................................................... 22
1.2.4 Arxula adeninivorans-Hefezellen-Assays ................................................. 24
1.2.5 Vor-Ort-Bestimmung östrogener Effekte mit dem EstraMonitor ................ 27
1.3 Erweiterte Abwasserreinigung mit Ozon ......................................................... 29
2. Zielstellung .......................................................................................................... 32
3. Materialien und Methoden .................................................................................. 33
3.1 Materialien ...................................................................................................... 33
3.1.1 Geräte ....................................................................................................... 33
3.1.2 Verbrauchsmaterialien .............................................................................. 34
I
Inhaltsverzeichnis
3.1.3 Software ................................................................................................... 34
3.1.4 Chemikalien, Lösungen und Medien ......................................................... 35
3.1.4.1 Hefeminimalmedium ........................................................................... 38
3.1.4.2 Natriumcitrat-Puffer ............................................................................ 39
3.1.4.3 Mobile Phasen für die LC-MS/MS ...................................................... 39
3.1.5 Verwendete Hefezellen ............................................................................. 39
3.1.6 Kläranlagen und Oberflächengewässer .................................................... 39
3.1.6.1 Krankenhaus-Kläranlage – Marienhospital Gelsenkirchen ................. 42
3.1.6.2 Kommunale Kläranlage – Duisburg-Vierlinden ................................... 42
3.1.6.3 Weitere untersuchte Kläranlagen ....................................................... 42
3.1.6.4 Oberflächengewässer ........................................................................ 43
3.2 Methoden ........................................................................................................ 44
3.2.1 Probenahme und Probenvorbereitung ...................................................... 44
3.2.1.1 Probenahme ....................................................................................... 44
3.2.1.2 Probenvorbereitung ............................................................................ 44
3.2.2 Parameter zur Untersuchung der bedarfsabhängigen Steuerung............. 45
3.2.3 Instrumentelle Methoden .......................................................................... 45
3.2.3.1 Bestimmung von hormonell aktiven Substanzen mittels HPLC-
MS/MS................................................................................................ 45
3.2.3.2 Bestimmung von Östrogenen mittels GC-MS ..................................... 48
3.2.4 Hefezellen-Assays .................................................................................... 49
3.2.4.1 Allgemeine Versuchsdurchführung des A-YES und des A-YAS ......... 49
3.2.4.2 Bestimmung von Matrixeffekten auf die Enzym-
Substrat-Reaktion ............................................................................... 51
3.2.4.3 Bestimmung der optischen Dichte der Hefezellensuspension ............ 52
3.2.4.4 Dosis-Wirkungsbeziehung in Umweltproben ...................................... 52
3.2.4.5 Berechnung der analytischen Äquivalentkonzentrationen .................. 52
II
Inhaltsverzeichnis
3.2.4.6 Messprinzip zur Bestimmung der antagonistischen Aktivität .............. 53
3.2.4.7 Messungen mit dem EstraMonitor ...................................................... 54
4. Ergebnisse ........................................................................................................... 57
4.1 Effekte verschiedener Matrices auf die Messwerte der Arxula
adeninivorans Assays ..................................................................................... 57
4.1.1 Matrixeffekte auf die Enzymaktivität ......................................................... 57
4.1.2 Matrixeffekte auf die optische Dichte der Zellsuspension ......................... 61
4.1.3 Matrixeinflüsse auf die Dosis-Wirkungsbeziehung .................................... 63
4.1.3.1 Einflüsse auf die Bestimmung der östrogenen Aktivität ...................... 63
4.1.3.2 Einflüsse auf die Bestimmung der androgenen Aktivität .................... 68
4.1.3.3 Verlauf der Dosis-Wirkungskurve bei Konzentrationen oberhalb
des maximalen Effektes ..................................................................... 73
4.1.4 Hormonelle Aktivität in Kläranlagen .......................................................... 74
4.1.4.1 Kläranlagen-Zuläufe ........................................................................... 75
4.1.4.2 Kläranlagen-Abläufe ........................................................................... 78
4.1.5 Biologische und analytische Äquivalentkonzentrationen .......................... 82
4.1.5.1 Östrogen aktive Substanzen .............................................................. 82
4.1.5.2 Androgen aktive Substanzen .............................................................. 83
4.2 Hormonelle Aktivität während der Ozonung von kommunalen Abwässern ..... 85
4.2.1 Reduktion hormonell aktiver Substanzen durch Ozon .............................. 85
4.2.1.1 Reduktion der östrogenen Aktivität ..................................................... 85
4.2.1.2 Reduktion der androgenen Aktivität ................................................... 87
4.2.2 Bedarfsabhängige Steuerung der Ozonung ............................................. 89
4.2.2.1 DOC-basierte Steuerung .................................................................... 89
4.2.2.2 Wirkungsbasierte Steuerung mit dem EstraMonitor ........................... 93
4.3 Hormonelle Aktivitäten während der Ozonung in einer Krankenhaus-
Kläranlage ....................................................................................................... 99
III
Inhaltsverzeichnis
4.3.1 Reduktion von hormonell aktiven Substanzen .......................................... 99
4.3.1.1 Östrogene Aktivität ............................................................................. 99
4.3.1.2 Androgene Aktivität .......................................................................... 101
4.3.2 Erhöhung der endokrinen Aktivität während der Ozonung ..................... 103
4.3.3 Bestimmung der anti-östrogenen und anti-androgenen Aktivität ............ 105
5. Diskussion ......................................................................................................... 110
5.1 Anwendbarkeit der A. adeninivorans-Assays in verschiedenen wässrigen
Matrices ........................................................................................................ 110
5.1.1 Beeinflussung der Enzymaktivität durch Umweltproben ......................... 110
5.1.2 Optische Dichte der Hefezellsuspensionen in Oberflächengewässern
und Abwässern ....................................................................................... 111
5.1.3 Effekte von Umweltproben auf die Dosis-Wirkungsbeziehung................ 113
5.2 Beurteilung der Anwendbarkeit des A-YES und des A-YAS zur Analytik
von wässrigen Umweltproben ....................................................................... 117
5.3 Bedeutung der gemessenen Aktivität im Zu- und Ablauf von Kläranlagen .... 120
5.4 Vergleich von instrumenteller und wirkungsbezogener Analytik ................... 123
5.5 Hormonelle Aktivität während der Ozonung von Kläranlagen-Abläufen ........ 127
5.6 Bedarfsabhängige Steuerung der Ozonung .................................................. 131
5.7 Antagonistische Aktivitäten in Umweltproben ............................................... 133
5.8 Bedeutung der Ergebnisse für die Analytik von hormonell aktiven
Substanzen und deren Regulation ................................................................ 136
6. Schlussfolgerungen und Fazit ......................................................................... 141
7. Literatur .............................................................................................................. 143
Danksagung ........................................................................................................... 165

IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1-1: Steroidhormon Grundgerüst Steran sowie Estran, Androstan und
Pregnan............................................................................................................... 3
Abbildung 1-2: Strukturformeln einiger östrogen aktiver Substanzen. ......................... 5
Abbildung 1-3: Strukturformeln einiger androgen aktiver Substanzen. ........................ 6
Abbildung 1-4: Funktionsprinzip des A-YES (nach Kunze et al. (2008) [197]).
Durch Integration des Rezeptor-Expressionsmoduls mit konstitutivem
Promotor in das Genom der Hefezelle wird der Rezeptor (R) synthetisiert.
Lagert sich an ihm eine hormonell-wirksame Substanz an, kommt es zur
Bildung eines Rezeptor-Ligand-Komplexes, der an die im Promoter des
Reporter-Expressionsmoduls enthaltene regulatorische Sequenz (RS)
bindet. Dadurch wird der Promotor dieses Moduls aktiviert, das Enzym
Phytase synthetisiert und dies zu mehr als 97% sezerniert, was sich über
eine Enzym-Substratreaktion messtechnisch erfassen lässt............................. 25
Abbildung 1-5: Enzymreaktion zum Nachweis von gebildeter Phytase über die
photometrische Bestimmung des Produktes. .................................................... 26
Abbildung 1-6: Aufbau des EstraMonitors. Wesentliche Elemente sind das
Schlauch- und Pumpensystem zur Dosierung aller benötigen Lösungen,
die beiden Inkubations- und Messzellen sowie die Steuereinheit.
Zusätzlich verfügt der EstraMonitor über eine Einheit zur thermischen
Inaktivierung der anfallenden Abfälle. ............................................................... 28
Abbildung 3-1: Schemata der Kläranlagen DU-Vierlinden (DU-VL) und
Marienhospital (MH). ......................................................................................... 40
Abbildung 3-2: Immobilisierung der Hefezellen als „Lentikats“. Eine
Hefezellsuspension wurde im Verhältnis 1:4 mit Lentikat® Lösung (PVA)
gemischt, als Tropfen auf eine glatte Oberfläche gegeben und getrocknet
[203]. ................................................................................................................. 55
Abbildung 3-3: Installation des EstraMonitors im Messtechnikraum der
Kläranlage DU-Vierlinden (A) und Anschluss über ein T-Stück an eine
bereits installierte Filtrationseinheit (B). ............................................................ 55
Abbildung 4-1: Korrelation zwischen Messwert (OD ) und Abwasseranteil
405nm
(natives Abwasser der Kläranlage DU-VL, Reinstwasser) im Messansatz
(n = 8). 100 mU/mL Phytase wurden zu unterschiedlichen Anteilen
Abwasser gegeben und mit Substratlösung (3,5 mM p
Nitrophenylphosphat in Natriumcitratpuffer (0,1 M, pH 3,9)) 60 min bei 37
°C inkubiert. 3 M NaOH Lösung wurde zum Abstoppen der Reaktion und
Herbeiführen des Farbumschlages zugegeben. ................................................ 58
Abbildung 4-2: Korrelation zwischen Messwert (OD ) und Abwasseranteil
405nm
(natives Abwasser der Kläranlage MH, Reinstwasser) im Messansatz (n =
5). 100 mU/mL Phytase wurden zu unterschiedlichen Anteilen Abwasser
gegeben und mit Substratlösung (3,5 mM p Nitrophenylphosphat in
Natriumcitratpuffer (0,1 M, pH 3,9)) 60 min bei 37 °C inkubiert. 3 M NaOH
Lösung wurde zum Abstoppen der Reaktion und Herbeiführen des
Farbumschlages zugegeben. ............................................................................ 59
V
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 4-3: Korrelation zwischen Messwert (OD ) und Abwasseranteil
405nm
(Abwasser-Extrakt der Kläranlage DU-VL, Reinstwasser) im Messansatz
(n = 8). 100 mU/mL Phytase wurden zu unterschiedlichen Anteilen
Abwasser gegeben und mit Substratlösung (3,5 mM p
Nitrophenylphosphat in Natriumcitratpuffer (0,1 M, pH 3,9)) 60 min bei 37
°C inkubiert. 3 M NaOH Lösung wurde zum Abstoppen der Reaktion und
Herbeiführen des Farbumschlages zugegeben. ................................................ 60
Abbildung 4-4: Korrelation zwischen Messwert (OD ) und Abwasseranteil
405nm
(Abwasser-Extrakt der Kläranlage MH, Reinstwasser) im Messansatz (n =
5). 100 mU/mL Phytase wurden zu unterschiedlichen Anteilen Abwasser
gegeben und mit Substratlösung (3,5 mM p Nitrophenylphosphat in
Natriumcitratpuffer (0,1 M, pH 3,9)) 60 min bei 37 °C inkubiert. 3 M NaOH
Lösung wurde zum Abstoppen der Reaktion und Herbeiführen des
Farbumschlages zugegeben. ............................................................................ 61
Abbildung 4-5: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
E2-Konzentrationen zu nativem kommunalem Abwasser der Kläranlage
DU-Vierlinden (80% v,v) im Vergleich zur Reinstwasser-Referenz
bestimmt mittels A-YES (n =3). ......................................................................... 63
Abbildung 4-6: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
E2-Konzentrationen extrahiertem kommunalem Abwasser der Kläranlage
DU-Vierlinden (80% v,v) im Vergleich zur Reinstwasser-Referenz
bestimmt mittels A-YES (n =3). ......................................................................... 65
Abbildung 4-7: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
E2-Konzentrationen zu nativen (A) und extrahierten (B) Abwasserproben
der Kläranlage MH (80% v/v) bestimmt mittels A-YES (n =3). .......................... 67
Abbildung 4-8: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
E2-Konzentrationen zu nativen (A) und extrahierten (B)
Oberflächengewässern (80% v/v) bestimmt mittels A-YES (n =3). ................... 68
Abbildung 4-9: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
DHT-Konzentrationen zu nativem kommunalem Abwasser der Kläranlage
DU-Vierlinden (80% v,v) im Vergleich zur Reinstwasser-Referenz
bestimmt mittels A-YAS (n =3). ......................................................................... 69
Abbildung 4-10: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
DHT-Konzentrationen zu extrahiertem kommunalem Abwasser der
Kläranlage DU-Vierlinden (80% v,v) im Vergleich zur Reinstwasser-
Referenz bestimmt mittels A-YAS (n =3). .......................................................... 70
Abbildung 4-11: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
DHT-Konzentrationen zu nativen (A) und extrahierten (B) Abwasserproben
der Kläranlage Marienhospital (80% v/v) bestimmt mittels A-YAS (n =3). ......... 72
Abbildung 4-12: Dosis-Wirkungskurven nach Zugabe verschiedener
DHT-Konzentrationen zu nativen (A) und extrahierten (B)
Oberflächengewässern (80% v/v) bestimmt mittels A-YAS (n =3). ................... 73
Abbildung 4-13: Messsignale unterschiedlicher E2-Konzentrationen im A-YES
vor und nach Korrektur anhand der optischen Dichte der Zellsuspension
(n = 3). ............................................................................................................... 74
VI
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 4-14: Östrogene Aktivität in Zuläufen der Kläranlagen DU-Vierlinden
(DU-VL), Marienhospital (MH) und Bad Sassendorf (BS). Ergebnisse von
SPE-Extrakten und Verdünnungen wurden auf die Konzentration der
unveränderten Probe extrapoliert. n zeigt die Anzahl der untersuchten
Proben............................................................................................................... 76
Abbildung 4-15: Androgene Aktivität in Zuläufen der Kläranlagen DU-Vierlinden
(DU-VL), Marienhospital (MH) und Bad Sassendorf (BS). Ergebnisse von
SPE-Extrakten wurden auf die Konzentration der nativen Probe
extrapoliert. n zeigt die Anzahl der untersuchten Proben. ................................. 77
Abbildung 4-16: Östrogene Aktivität in Abläufen verschiedener Kläranlagen
(KA) bestimmt mittels A-YES. Ergebnisse von SPE-Extrakten wurden auf
die Konzentration der nativen Probe extrapoliert. n zeigt die Anzahl der
untersuchten Proben. ........................................................................................ 79
Abbildung 4-17: Androgene Aktivität in Abläufen verschiedener Kläranlagen
(KA) bestimmt mittels A-YAS. Ergebnisse von SPE-Extrakten wurden auf
die Konzentration der nativen Probe extrapoliert. n zeigt die Anzahl der
untersuchten Proben. ........................................................................................ 81
Abbildung 4-18: Effizienz des Ozoneintrages der Injektor- und Diffusorstraße in
Abhängigkeit der Ozondosis bei einer Q-proportionalen und einer
DOC-proportionalen Steuerung der Ozonung. .................................................. 90
Abbildung 4-19: Korrelation der Elimination von Diclofenac, 1H-Benzotriazol
und Sulfamethoxazol bestimmt mittels LC-MS/MS mit der DOC-
Konzentration im Zulauf zur Ozonanlage. Experimente wurden bei einer
mengenproportionalen Dosierung von 2 mg/L Ozon durchgeführt. ................... 91
Abbildung 4-20: Korrelation der Konzentration von Diclofenac, 1H-Benzotriazol
und Sulfamethoxazol im Ablauf der Ozonanlage in Abhängigkeit der DOC-
Konzentration im Zulauf der Ozonanlage. Experimente wurden bei einer
mengenproportionalen Dosierung von 2 mg/L Ozon durchgeführt. ................... 92
Abbildung 4-21: Kalibrationsreihe mit E2 im EstraMonitor bei automatisiertem
Betrieb dargestellt als Einzelwerte. Unterschiedliche E2-Konzentrationen
wurden mit 8 Hefe-Linsen intern im EstraMonitor inkubiert. Zur
Bestimmung der Phytaseaktivität wurde das Substrat Ascorbinsäure 2-
phosphat in 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3,9) zugegeben und das
biochemische Signal amperometrisch erfasst. Der EC liegt bei 39 ng/L
50
E2. ..................................................................................................................... 94
Abbildung 4-22: Amperometrische Messung eines E2 Standards mit 1 ng/L (A)
und 10 ng/L (B) sowie das Grundrauschen zweier Sensoren im Vergleich
(C). .................................................................................................................... 95
Abbildung 4-23: Erhöhung der östrogenen Aktivität nach Ozonung in den
Kläranlagen DU-Vierlinden (DU-VL) und Marienhospital (MH) (n = 2). ........... 104
Abbildung 4-24: Erhöhung der androgenen Aktivität nach Ozonung in den
Kläranlagen DU-Vierlinden (DU-VL) und Marienhospital (MH) (n = 2). ........... 105
Abbildung 4-25: Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve der Referenzsubstanz
4-Hydroxytamoxifen (OHT) zur Bestimmung der anti-östrogenen Aktivität
(n = 8). ............................................................................................................. 106
VII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 4-26: Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve der Referenzsubstanz
Flutamid zur Bestimmung der anti-androgenen Aktivität (n = 8). .................... 106
Abbildung 4-27: Anti-östrogene Aktivität nativer Abwasserproben der Kläranlage
Marienhospital aus dem Zulauf, nach MBR, nach Ozonung (O ) und nach
3
Sandfiltration (SF) bestimmt mittels A-YES (n = 2). ........................................ 107
Abbildung 4-28: Anti-androgene Aktivität nativer Abwasserproben der
Kläranlage Marienhospital nach MBR, nach Ozonung (O ) und nach
3
Sandfiltration (SF) bestimmt mittels A-YAS. .................................................... 108

VIII