Der Nachweis kleinster CO-Mengen in Körperflüssigkeiten

34 Pages·1958·1.936 MB·German

by  Dipl.-Physiker Karl Sellier (auth.)

FORSCH UNGSBERICHTE
DES WIRTSCHAFTS- UND VERKEHRSMINISTERIUMS
NORDRHEIN-WESTFALE N
Herausgegeben von Staatssekretär Prof. Dr. h. c. Dr. E. h. Leo Brandt
Nr.555
Dipl.-Physiker Karl Sellier
Der Nachweis kleinster CO-Mengen in KörperAüssigkeiten
Aus dem Institutfür Gerichtliche Medizin der Universität Bonn
(Direktor: Prof. Dr. med. H. Elbel)
Als Manuskript gedruckt
Springer Fachmedien Wiesbaden GmbH
ISBN 978-3-663-03389-9 978-3-663-04578-6 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-663-04578-6
Forsohungsberiohte des Wirtschafts- und Verkehrsministeriums Nordrhein-Westfalen
G 1 i e d e run g
. . . . . . . . . .
A. Einführung · · s. 5
. . . . . . .
B. Theoretische Überlegungen · · s. 5
c.
Verbesserung der Methodik zur Erzielung
höherer Nachweisempfindlichkeit • • • • • • • • • • • S. 12
D. Eichung des Verfahrens,
eigene Messungen . .. . . s. 11
E. Zusammenfassung • • S. 21
Literaturverzeichnis ••••••• S. 22
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A. Einführung
Zum Nachweis im Blut können im wesentlichen drei Methoden angewandt wer
den: die gasanalytische, die chemische und die optische Methode. Die
erste beruht darauf, daß nach Austreiben der im Blut enthaltenen Gase
diese gasanalytisch untersucht werden; diese Methode ist die genaueste,
erfordert jedoch besondere Geräte, genaues Arbeiten und viel Zeit. Die
chemische Methode ist bequem, erfordert wenig Zeit und benötigt keine
besonderen Geräte. Kleine CO-Mengen können nicht erfaßt werden. Die
Farbe oder der Farbumschlag des bei der chemischen Umsetzung entstehen
den Stoffes kann nur subjektiv beurteilt werden. Die optische Methode
vereinigt sowohl die Vorzüge der gasanalytischen (Genauigkeit, groBe
Empfindlichkeit) als auch die der chemischen Methode (Schnell~gkeit,
kein besonderer Aufwand an Geräten, denn Photometer dürften in fast
allen Instituten vorhanden sein).
Eine große Zahl von Vorschlägen und Ausführungsvorschriften für optische
Bestimmungsmethoden des CO-Rb ist veröffentlicht worden. Die bekannte
sten sind die von REILMEYER, OETTEL, MAY. Neuere Untersuchungen sind
von SCRWERD, ZIJLSTRA, KURZ und WALLER.
REILMEYER benutzt die Wellenlängenpaare 541-560 nm und 516-560 nm, OETTEL
das Paar 530-510 nm (Filterschwerpunkte). KURZ und WALLER schlagen 519
und 569 nm für das Spektralphotometer und 518 und 569 nm (Rg-Linien)
für das Eppendorf-Photometer vor. Die Autoren messen sowohl im System
CORb-0 Rb als auch im System CORb-Rb nach Reduktion.
2
Es erhebt sich nun die Frage, ob und nach welchen Gesichtspunkten aus
der Vielzahl der vorgeschlagenen Wellenlängen-Paare zwei so bestimmt
werden können, daß eine optimale untere Nachweisgrenze erreicht wird.
Es soll also prinzipiell die Leistungsfähigkeit der optischen Methode
untersucht werden und eventuell ein Weg gefunden werden, die untere
Nachweisgrenze weiter nach unten zu drücken. Dies ist das Ziel der vor
liegenden Arbeit.
B. Theoretische Überlegungen
Betrachtet man zwei Farbstoffe A und B, die bestimmte Absorptionskurven
besitzen, so haben diese bei den Wellenlängen A1 und A2 die Extinkti
onswerte a und a für den Stoff A und b und b für den Stoff B. Wenn
1 2 1 2
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E
"1 "2
A b b i 1 dun g 1
Erklärung der Konstanten a ••• b
1 2
nun eine Mischung von Stoff A und B vorliegt, erhält man bei der Wellen
A
länge die resultierende Extinktion E :
1 1
(1)
A
dasseIbe für 2:
x bedeutet dabei den Gehalt des Farbstoffes A in der Mischung, ,!obei
~go
x = ist. n ist der i_Gehalt des Farbstoffes. Ist A allein vorhanden,
so ist x = 1. Der Quotient Q
ist unter gewissen Voraussetzungen ein eindeutiges Maß für x, d.h. ist
Q bekannt, kann daraus x berechnet werden. Aus (1), (2) und (3) errech
net sich x zu:
x
Die Voraussetzungen der Eindeutigkeit sind:
1. Monochromatisches Licht (d.h. Erfüllung des Lambert-Beerschen
Gesetzes),
2. Es dürfen keine anderen Farbstoffe in der Lösung bzw. Mischung
vorliegen, es sei denn, ihre Extinktion bei den verwendeten zwei
Wellenlängen sei klein gegenüber den von A und B.
3. Keine Trübung der Mischung.
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Punkt 3 spielt bei der Wahl der geeigneten Wellenlängen eine Rolle. Wir
kommen unten darauf zurück.
Q als Funktion von x oder umgekehrt stellt eine Kurve dar, die im allge
meinen Fall keine Gerade ist (Abb. 2). Die Kurve kann konkav, gerade
oder konvex gegen die Abszisse sein. Dies hängt von den Konstanten a ",
1
b ab. Man kann nun durch die Wahl der beiden Wellenlängen der Eich-
2
kurve x = f(Q) die Gestalt a, b oder c geben. Für unsere Zwecke, nämlich
gute Nachweisempfindlichkeit des Stoffes A in B, d.h. bei x = 0 bzw.
x ~ 1, muß die Kurve die Bedingung erfüllen, daß zu einer großen Ände
rung von Q eine kleine Änderung von x gehört. Diese Bedingung erfüllt
die Kurve c.
A b b i 1 dun g 2
Verschiedene Form der Eichkurve x f(Q)
Bei x = 1 ist bei c das Umgekehrte der Fall. Hier gehört zu einer klei
nen Änderung von Q eine große Änderung von x. Es wird also nuran einer
~telle der Kurve die obige Bedingung erfüllt. Das spielt bei unseren
Uberlegungen aber keine Rolle, da es uns nur auf die Umgebung x = 0 an
kommt. Eine gleichbleibende Empfindlichkeit erzielt die Gerade b. Hier
ist die Änderung von x mit Q (also der Differentialquotient) immer gleich.
Wie müssen nun die Wellenlängen und damit die Konstanten a •• b gewählt
aus~edrückt
werden, damit die obige Bedingung erfüllt wird? Mathematis6h
heißt diese:
(~~)x
<C1 möglichst klein!
Zur Bildung des Ausdrucks (5) wird (4) differenziert, und man erhält:
[(a1-b1)·x+b1]·[(a2-b2)·x+b2]
(6) II
dp b ·(a -b ) - b ·(a -b )
2 1 1 1 2 2
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dp ist die Abkürzung für den Ausdruck dQ/Q. Dieser ist gewählt worden,
weil nicht der Absolutfehler dQ maßgebend in das Meßergebnis eingeht,
sondern der Relativfehler dQ/Q. Für unsere Untersuchung interessiert
° °
nur das Ergebnis dx/dp an der Stelle x = bzw. ~ 1. x = in (6) ein
gesetzt, vereinfacht diese wesentlich und man erhält:
1
dx in (7) ist nichts anderes als die untere Nachweisgrenze des Stoffes
A in B, wenn dp und die Konstanten a •• b eingesetzt werden. Soll dx
1 2
sehr klein werden, muß der Ausdruck
(s)
durch Wahl der geeigneten Wellenlängen sehr groß gemacht werden.
Um diesen Ausdruck (S) übersichtlich darzustellen und damit die Wahl der
Wellenlängen zu überblicken, wurde der Quotient alb als Funktion der
Wellenlänge (a in diesem Falle für GOHb und b für 02Hb bzw. Hb) aufge
tragen. Man muß in dieser Darstellung nur zwei alb-Werte finden, die
eine möglichst große Differenz aufweisen, um den Ausdruck (S) groß zu
machen. Als ein günstiges Gebiet erweist sich das ferne Rot, als ande
res die Wellenlängen 420, 4S0 oder 530 nm. Der Wert (S) für 4S0 und
700 nm ergibt etwa 1,6. Für dx ergibt sich daraus dX ,700 = 0,7·dp.
4SO
Dieser Wert 0,7 ist der für die vorgegebenen Spektralkurven überhaupt
niedrigste. Für dp läßt sich etwa 1% einsetzen, so daß die theoretisch
mögliche Nachweisgrenze von GORb in Hb etwa 0,7% beträgt. Für das
System GOHb-0 Hb liegen die Verhältnisse ungünstiger. Zu dem Photo
2
meterfehler kommen noch die Fehler, die durch die Eigenschaften des
biologischen Materials (Trübung, andere Farbstoffe) verursacht werden.
Der oben genannte Wert kann sich also nur verschlechtern und bildet
somit eine theoretische Grenze des praktisch Möglichen.
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fDIJ 700 800
A b b i I dun g 3
Der Quotient alb als Funktion der Wellenlänge für die beiden
Stoffsysteme CO-Rb und Rb bzw. CO-Rb und 02-Rb
Es erhebt sich nun die Frage, ob die theoretisch gewonnenen optimalen
Wellenlängen auch in Rinsicht auf die biologischen Eigenschaften des
Materials die besten darstellen. Diese Frage ist leider zu verneinen.
Man müßte nämlich (bei Anwendung der Wellenlängen 480 und 100 nm) bei
480 nm eine ziemlich verdünnte Lösung verwenden wegen der starken Absorp
tion in diesem Gebiet, bei 100 nm jedoch eine ziemlich konzentrierte
Lösung wegen der sehr schwachen Absorption. Man muß somit zwischen den
beiden Messungen definiert verdünnen, da der Verdünnungs-Faktor in das
Meßergebnis mit eingeht. Weiterhin ist der blaue Spektralbereich nicht
günstig. Bekanntlich geht die Streuung des Lichtes mit 11). 4, d.h., bei
Trübung einer Läsung (mit der man rechnen muß) ist die Streuung im
blauen Bereich über zehnmal größer als im roten. Ein weiterer Punkt, der
bei der Wahl der Wellenlängen in Betracht gezogen werden muß, ist fol
gender: Eine bestimmte Wellenlänge läßt sich im Spektralphotometer nur
mit einer gewissen Genauigkeit einstellen. Mißt man nun bei einer Wellen
länge, die sich in der Flanke einer Absorptionsbande befindet, so treten
schon durch geringe Änderung in der Wellenlängen-Einstellung starke
Schwankungen in der Extinktionsmessung auf. Man muß also nach Möglichkeit
entweder im Maximum oder Minimum der Spektralkurve messen, weil sich
dort die Fehler der Wellenlängeneinstellung am wenigsten bemerkbar machen.
Die Monochromasie der Strahlung spielt aus zwei Gründen eine wichtige
Rolle bei der Messung. Erstens wird nur unter dieser Voraussetzung der
Quotient Q invariant gegen die Konzentration der Farbstoff-Lösung,
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Cl
1,0
0,5 1,0
A b b i 1 dun g 4
Abhängigkeit des Quotienten ES 53/Es 57 von der Konzentration
der Blutlösung beim OETTELschen Verfahren
zweitens wird die Differenz (8) kleiner, wenn nicht die zwei Wellenlängen
A und A ' sondern ein gewisser Bereich ·A1~~A1 und A2~~A2 zur
1 2
Messung der Extinktion verwandt wird. Der erste Effekt, der bei allen
Photometern, die mit Filtern arbeiten, auftritt und damit auch der
OETTELschen Methode anhaftet, kann dadurch beseitigt werden, daß auf
die "Konzentration Null" der Farbstofflösung extrapoliert wird. Der Q-Wert
strebt dann einem Grenzwert zu, der natürlich von der Verdünnung der Lö
sung unabhängig ist. Ein Beispiel, angewandt auf die OETTELsche Methode,
soll diesen Sachverhalt zeigen. Man mißt die Probe zunächst bei so großer
Konzentration, daß die Werte am Photometer gerade noch abgelesen werden
können (E ~ 1) und stellt dann beliebige Verdünnung her, die immer wieder
mit Filter S53 und S57 gemessen werden. Dann wird der Q-Wert = E(S53/E(S57)
gegen die Extinktion für S53 aufgetragen. Die so erhaltenen Punkte werden
verbunden und die dadurch gezogene Gerade bis zur Ordinate (d.h.E(S53)=O!)
verlängert. Dieser Quotient Q bedeutet das Extinktionsverhältnis für die
Konzentration Null. Das Verfahren hat noch den Vorteil, daß bei hinrei
chend vielen Punkten der Schnittpunkt der Geraden sehr genau bestimmt
werden kann. Allerdings tritt mit zunehmender Verdünnung eine Dissozia
tion des CORb auf, die bei 200facher Verdünnung etwa 1-2% CORb beträgt.
Da das Verfahren aber sowieso keine größere Genauigkeit zeigt, kann dieser
Fehler hingenommen werden. Der zweite Effekt, den die mangelnde Monochro
masie der Strahlung hervorruft, daß nämlich die Differenz (8) kleiner
wird, beruht darauf, daß jetzt nicht mehr der Wert a1/b1 bzw. a / b in
2 2
die Rechnung eingeht, sondern der Mittelwert alb, gemittelt über das In
tervall 2 ßA • Die beiden in der Abbildung 5 schraffierten Flächen müssen
zur Mittelwertbildung in flächengleiche Rechtecke verwandelt werden.
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A b b i 1 dun g 5
Einfluß spektraler Unreinheit auf den Wert alb
Die Höhe der Rechtecke ist nun der gemittelte alb-Wert. Man sieht sehr
6A
gut, daß mit zunehmenden die resultierenden alb-Werte beim Maximum
immer kleiner, beim Minimum immer größer werden, die Differenz der bei
den alb-Werte also immer kleiner wird, d.h. die Nachweisempfindlichkeit
sinkt.
Eine weitere große Rolle beim Nachweis geringer COHb-Mengen im Blut spie
len die Verunreinigungen mit Hämoglobin und Hämiglobin, allerdings nur
dann, wenn zur Messung das System COHb-O?Hb verwendet wird. Geht man aber
vom System COHb aus, dann wird durch die Reduktion auch das Hämiglobin
in B einbezogen, es können aber dann durch das Reduktionsmittel unkon
trolIierte Trübungen auftreten, beim Natriumdithionit durch Ausfallen
vom kolloidalem Schwefel, der zu Falschmessungen führen kann. Im alka
lischen Bereich und bei Anwendung geringster Mengen Natriumdithionit
kann dieser Fehler fast vollständig vermieden werden. Um den Fehler,
der durch einen zusätzlichen Farbstoff im Zweistoff-System entsteht,
berechnen oder abschätzen zu können, werden die Gleichungen (1), (2)
und (3) erweitert. C sei der Störfarbstoff, c und c seine Extinktionen
1 2
bei den zwei Wellenlängen, die zur Messung herangezogen sind, y sein
Anteil an der Mischung. Dann ergibt sich:
(10)
Daraus berechnet sich dann x zu:
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