ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sina AKAN ...

101 Pages·2010·0.89 MB·Turkish

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Sina AKAN

KERATİNOLİTİK BACILLUS sp. SUŞLARININ İZOLASYONU,
KERATİNAZ ÜRETİMİ VE KARAKTERİZASYONU

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2010
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KERATİNOLİTİK BACILLUS sp. SUŞLARININ İZOLASYONU, KERATİNAZ ÜRETİMİ VE
KARAKTERİZASYONU

Sina AKAN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

BİYOLOJİ ANA BİLİM DALI

Bu tez 16/08/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu
İle Kabul Edilmiştir.

…………………….. ………………………. ……………... ……...
Doç. Dr. Hatice Korkmaz Prof. Dr. Burhan ARIKAN Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ
DANIŞMAN ÜYE ÜYE

Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında Hazırlanmıştır.
Kod No:

Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL
Enstitü Müdürü

Bu Çalışma Ç. Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.
Proje No: FEF2010YL5

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların
kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 Sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
ÖZ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

KERATİNOLİTİK BACILLUS sp. SUŞLARININ İZOLASYONU, KERATİNAZ
ÜRETİMİ VE KARAKTERİZASYONU

Sina AKAN

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman : Doç. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ
Yıl: 2010, Sayfa: 88
Jüri : Doç. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ
: Prof. Dr. Burhan ARIKAN
: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ

Bu çalışmada, tavuk üretim çiftliği toprağından 21 proteolitik (skim-milk agarda)
Bacillus suşu izole edilmi ş, bunlardan 8 tanesi keratin -azure substratı ile keratinolitik
aktivite göstermiştir. HSK-21 nolu su ş en iyi keratinaz üreticisi olarak seçilmiş ve
VITEK-2 bakteri tanılama sistemi ile Bacillus sp. olarak tanılanmıştır. Keratinaz üretimi
için temel tüylü b esiyeri kullan ılmış ve maksimum enzim aktivitesi pH=8.0’de,’de
gözlenmiştir.
Enzim pH 5.0-13.0 ve 20-60ºC aralıklarında aktivite göstermiş ancak optimum
aktivite pH=12.0 ve 40ºC’de saptanmıştır. Enzim farklı tamponlarla (pH=7.0-13.0) 30 dk
muamele edildi ğinde ortalama %50 -100 oran ında aktifli ğini korumuş, pH 11.0 ve
12.0’de aktivite %100 korunmuştur. Enzim 20-100ºC’lerde 30 dk inkübe edildiğinde 20-
60ºC’lerde yaklaşık %34-86 oranında kalan aktivite saptanmış ve 30ºC’de aktivite %100
korunmuştur.
SDS-PAGE (jelatin içeren) analizinde proteolitik aktivite gösteren 3 farkl ı
büyüklükte (46.8 kDa, 26 kDa ve 21.9 kDa) protein bandı saptanmıştır.
Enzim inhibitörleri ve metal iyonlar ının 1-5 mM konsantrasyonlar ı ile 30 dk
inkübasyondan sonra, Na SO (%42), CaCl (%39), PMSF (%34), Phenyl Glyoxal
2 3 2
(%23), üre (%15) enzim aktivitesini indüklemiş, N-Bromo süksinimit ve ZnCl aktiviteyi
2
tamamen inhibe etmiştir. HgCl (%66), SDS (%56), EDTA (%46), Ethyl acetimidate
2
(%32), MgCl (%15) aktivitede düşmeye neden olurken, KCl ve NiCl önemli bir etki
2 2
yapmamıştır.
Koyun derisi kesitlerindeki yünler, pH=12.0’de ve 40ºC’de deri bütünlü ğü
bozulmadan tamamen uzaklaşmıştır (dehairing).
Sonuç olarak; Bacillus sp. HSK-21 nolu izolattan üretilen keratinaz ; keratinoliz
gerektiren biyoteknolojik uygulamalarda mezofil ve yüksek alkali koşullar için uygundur
ve şimdiye kadar literatürlerde bildirilen bakteriyal keratinazlardan daha yüksek pH’da
aktif bir enzimdir.

Anahtar Kelimeler: Bacillus sp. HSK-21, alkali keratinaz, dehairing
I
ABSTRACT

MSc THESIS

ISOLATION OF KERATINOLYTIC BACILLUS SP. STRAINS, KERATINASE
PRODUCTION AND CHARACTERIZATION

Sina AKAN

ÇUKUROVA UNIVERSITY
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT OF BIOLOGY

Supervisor : Assoc. Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ
Year: 2010, Pages: 88
Jury : Assoc. Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ
: Prof. Dr. Burhan ARIKAN
: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ

In this study, twentyone proteolytic (on skim-milk agar) Bacillus strains were
isolated from poultry soil. Eight strains of these bacteria were showed keratinolytic
activity when keratine azure used as substrat.
HSK-21 strain was chosen the best keratinase producer and identified as
Bacillus sp. via VITEK-2 (bioMerieux) bacteria identification system.
The basal feather medium was used for keratinase production and maximum
enzyme activity measured at pH=8.0 and 30ºC.
The enzyme was active at p H 5.0-13.0 and at 20 -60ºC, though optimum
activity was obtained at pH=12.0 and 40ºC.
When the enzyme tested at different buffers (pH 7.0-13.0) for 30 sec. , 50-
100% activity remained and the activity (100%) was stab le at pH=11.0 and
pH=12.0. When the enzym e incubated at 20 -100ºC for 30 sec., 34 -86% activity
retained at 20-60ºC, while 100% activity was seen at 30ºC.
Three different (46,8 kDa, 26 kDa and 21.9 kDa) proteolytic activity protein
bands were revealed with SDS-PAGE (with gelatin).
After incubation for 30 sec. with enzyme inhibitors and metal ions (1-5 mM),
Na SO (%42), CaCl (%39), PMSF (%34), Phenyl Glyoxal (%23), urea (%15)
2 3 2
induced enzyme activity and N-Bromo süksinimide and ZnCl inhibited completely.
2
While HgCl (%66), SDS (%56), EDTA (%46), Ethyl acetimidate (%32), MgCl
2 2
(%15) decrased activity, KCl ve NiCl didn’t cause any effect. The wool were
2
succesfully dehaired from sheep leather pieces at pH=12.0 and 40ºC.
The results showed that, the keratinase from Bacillus sp. HSK-21 is useful for
mesophilic and highly alkaline conditions in biotechnological applications requiring
in keratinolisis and the enzyme was the only bacterial keratinases working high pH
conditions (optimum pH=12.0) documented in the literatures so far.

Key Words: Bacillus sp. HSK-21, alkaline keratinase, dehairing
II
TEŞEKKÜR

Hayatım boyunca bana verdiklerini unutamayaca ğım, her yönden
desteğini yanımda hissetti ğim, umutsuz zama nlarımda beni aydınlatan, gelece ğe
umutla bakmam ı sa ğlayan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Hatice KORKMAZ
GÜVENMEZ’e, destekleriyle ve yardımlarıyla her zaman yan ımda olan Prof. Dr.
Burhan ARIKAN, Prof. Dr. İskender EMRE ve Prof. Dr. Sadık DİNÇER hocalarıma
teşekkür ederim.
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü öğretim üyesi değerli
hocam Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ’e katkıları için teşekkür ederim.
Yardımlarını esirgemeyen Dr. Ayşenur KAYA’ya, Yard. Doç. Dr.
Gülizar ATLI’ya ve manevi deste ğinden dolayı Prof. Dr. Cengiz DARICI’ya , Ar.
Gör. Burak KOÇAK ve Ar. Gör. Erman Salih İSTİFLİ’ye, bölüm sekreterimiz
Mediha KURTOĞLU’na teşekkür ederim.
Hayatta her zaman en büyük destekçilerim ve daima yanımda olan canım
annem Pelin AKAN’a, babam Nezih AKAN ’a, kardeşim Tibet AKAN’a, Tolunay
BATTAL’a, Şule BATTAL’a, Buket BATTAL’a, Şeyma BATTAL’a, biricik AFS
ailem GANTA A İLESİ’ne, arkadaşlarım Dilek KOMZA, Şevin GÖKÇE, Müge
ERCAN, Ahmet TEZER, Tevfik GÜZELBEY, Burak KELLEC İ ve Ülker
PAKSOY’a teşekkür ederim.

III
İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ …..………………………………………………………………………………...I
ABSTRAKT …..……………………………………………………………………..II
TEŞEKKÜR ..……………………………………………………………………….III
İÇİNDEKİLER …….……………………………………………………………….IV
ÇİZELGELER DİZİNİ …….……………………………………………………..VIII
ŞEKİLLER DİZİNİ ...……………………………………………………………......X
1. GİRİŞ ………………………………………………………………….…………..1
1.1. Enzimler …..…………………….…………………........................................3
1.1.1. Mikrobiyal Enzimler ..……………...………………..….………..……4
1.1.2. Mikrobiyal Proteazlar .……......…………....……….….......................5
1.2. Keratinler ...………....…...…………………..………..……………………...6
1.3. Keratinazlar ………………………………………............….………..….......9
1.3.1. Bakteriyel Keratinazlar ……………………………………..................9
1.3.2. Keratinazların Biyokimyası …………...…………………………......10
1.3.3. Keratinazların Üretimi ……..……….……………………………………....12
1.3.4. Keratinden- Zengin Atıkların Biyolojik Islahı …...……………………….13
1.3.5. Keratinazlar için Yeni Uygulamalar ……...……………..……...……14
1.4. Keratinaz Üreten Mikroorganizmalar Arasındaki Çeşitlilik …...…………...18
1.5. Bacillus …...………………………………………………………...............21
1.6. Doğal Proteinlerin Hidrolizi ………………………………...……………...22
1.7. Amaç ……………………….……………………………………………….24
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ……………………………………...…………..……25
3. MATERYAL VE METOD ….………………...………………………….......….33
3.1. Materyal …...…………………………………….………………………….33
3.1.1. Bakteri İzolasyonunda ve Tanılanmasında Kullanılan Besiyerleri …..33
3.1.1.1. Temel Tüylü Besiyeri ……………………...………...……...33
3.1.1.2. Jeloz Besiyeri …………..………………………………...….34
3.1.1.3. N1 Besiyeri …...…..……………………..…………………..34
3.1.1.4. LB Broth (Luria-Bertoni Broth) ……..………………………34
IV
3.1.1.5. Skimmilk-Agar ………………………………...……...……..35
3.1.1.6. Triptik Soy Agar …...……………………………….……….35
3.1.2. Kullanılan Tampon ve Çözeltiler ............................………………….36
3.1.2.1. Keratin Azure …...……………………………………...……36
3.1.2.2. Sitrat-Fosfat Tamponu ……...……………………………….36
3.1.2.3. Fosfat Tamponu …...………………………………………...36
3.1.2.4. Tris-HCl Tamponu ……...…………………………………...37
3.1.2.5. Karbonat-Bikarbonat Tamponu ……...…………………..….37
3.1.2.6. Boraks Tamponu ……...…………………………………..…38
3.1.3. Enzim İnhibitörleri ve Metal İyonları ………...……………………...38
3.1.4. Elektroforez Uygulamalarında Kullanılan Çözeltiler ………...……...39
3.1.4.1. Solüsyon-A (Akrilamid Stok Solusyonu)…………………….39
3.1.4.2. Solüsyon-B (4X Separating Jel Tamponu) …………………..40
3.1.4.3. Solüsyon-C (4X Stacking Jel Tamponu) ………………….....40
3.1.4.4. AMPS (%10 Amonyumpersulfat) ……….…………………...40
3.1.4.5. Elektroforez Tamponu …….…………………………………41
3.1.4.6. Örnek Tamponu (1X Sample Buffer) …….………………….41
3.1.4.7. TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylene-ethylenediamine) …...41
3.1.4.8. SDS-PAGE Boyama Solüsyonu (CBB R-250) ……………...42
3.1.4.9. Jelden Boyayı Geri Alma (destaining) Solüsyonu …….……..42
3.1.4.10. İstenilen Konsantrasyonda Ayırıcı Jelin Hazırlanması ……..42
3.1.4.11. Triton X-100 (%2.5, v/v) Çözeltisi …….…………………...43
3.1.4.12. Tris-HCl (50 mM, pH=7.5) Çözeltisi …….…………...……43
3.1.4.13. TCA (Trichloroacetic acid, %10 wt/vol) Çözeltisi ………....43
3.1.4.14. Protein Marker (SDS6H2, MW=30.000-200.000) ………....43
3.2. Metod ………………………………………………………………………..44
3.2.1. Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ….……………………..44
3.2.1.2. Proteaz Aktivitesinin Skimmilk Besiyerinde Saptanması …...45
V
3.2.2. Bakterilerin tanılanması ……...……………...……………………......45
3.2.3. Keratinaz Enziminin Üretilmesi …………...…………………………45
3.2.4. Enzimin Etanol (Et-OH) ile Çöktürülmesi ………...…………………46
3.2.5. Keratinolitik Aktivitenin Belirlenmesi ……...………………………..46
3.2.6. Keratinaz Üretiminde En Uygun Besiyeri pH’sının Saptanması ……..47
3.2.7. Keratinaz Üretiminde Uygun İnkübasyon Sıcaklığının Belirlenmesi ..47
3.2.8. Keratinaz Aktivitesi Üzerine pH’nın Etkisi …………………………..47
3.2.9. Sıcaklığın Keratinaz Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi ……..48
3.2.10. Sıcaklığın Enzim Kararlılığına Etkisi ……………………………….48
3.2.11. pH’nın Enzim Kararlılığına Etkisi …………………………………..49
3.2.12. Keratinaz Aktivitesi Üzerine Kimyasalların Etkisi ………………….49
3.2.13. Elektroforetik Analiz (SDS-PAGE) …………………………………49
3.2.14. Deri Yünlerinin Keratinaz ile Uzaklaştırılması (dehairing) ……...…50
4. BULGULAR VE TARTIŞMA …...………………………...………………....…51
4.1. Bakterilerin izolasyonu ………………………………………………...…...51
4.2. Proteolitik Aktivitenin Saptanması …………………………………………52
4.3. Keratinaz Üreten Suşların Tanımlanması …………………………………..53
4.4. Keratinolitik Aktivite Gösteren Suşların Saptanması ………………………57
4.5. Keratinaz Üretiminde Besiyeri pH’sı ve Kültür Sıcaklığının Etkileri ……...58
4.6. Optimum pH ………………………………………………………………..59
4.7. pH’ın Enzim kararlığına Etkisi (stabilite) …………………………………..61
4.8. Optimum Sıcaklık …………………………………………………………..62
4.9. Sıcaklık Stabilitesi ………………………………………………………….63
4.10. Enzim İnhibitörleri ve Metal İyonlarının Keratinaz Üzerine Etkileri ……..65
4.11. Elektroforetik Analiz Sonuçları …………………………………………...68
4.12. Keratinazın Deri Yünlerinin Uzaklaştırılmasındaki Etkinliği (dehairing) ...69

VI
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ………………………………………………...…71
6. KAYNAKLAR ………………………………………………………………..…75
ÖZGEÇMİŞ …………………………………………………………..………....….88

VII
ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 1.1. Bazı tüy parçalayan bakteri izolatlarının orijini ………………………10
Çizelge 1.2. Bazı bakteriyal keratinazların biyokimyasal özellikleri ………………12
Çizelge 3.1. Sitrat-fosfat tamponu çözeltilerinin hazırlanması ………….………….36
Çizelge 3.2. Fosfat tamponu çözeltilerinin hazırlanması …………………………...37
Çizelge 3.3. Tris-HCl tamponu çözeltilerinin hazırlanması ……………………......37
Çizelge 3.4. Karbonat-bikarbonat tamponu çözeltilerinin hazırlanması …………...38
Çizelge 3.5. İnhibitörler, metal iyonları ve kullanılan konsantrasyonlar ……….......39
Çizelge 3.6. SDS6H2 içindeki protein karışımı …………………………………….44
Çizelge 4.1. Çeşitli organizmalardan üretilen keratinazların aktivite sıcaklıkları ….63
Çizelge 4.2. Kimyasalların enzim aktivitesi üzerine etkisi …………………………65
Çizelge 4.3. Bazı keratinazların SDS-PAGE’de saptanan moleküler ğırlıkları ….....69

VIII