ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Fezel NİZAM ...

132 Pages·2010·0.88 MB·Turkish

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

Fezel NİZAM

FLUOKSETIN’İN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO
GENOTOKSİK ETKİLERİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2010
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

FLUOKSETIN’İN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO
GENOTOKSİK ETKİLERİ

Fezel NİZAM

YÜKSEK LİSANS TEZİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu Tez ….………. Tarihinde A şağıdaki Jüri Üyeleri Taraf ından
Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmi ştir.

………………............................. ……………………………….. ……...........................
Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Hasan Basri İLA
DANIŞMAN ÜYE ÜYE

Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır.
Kod No:

Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL
Enstitü Müdürü

Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.
Proje No: FEF2009YL57

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak
gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
ÖZ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

FLUOKSETIN’İN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO
GENOTOKSİK ETKİLERİ

Fezel NİZAM
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTA Ş
Yıl :2010, Sayfa: 111
Jüri :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTA Ş
Prof. Dr. Rü ştü HATİPOĞLU
Doç. Dr. Hasan Basri İLA

Bu çal ışma, Fluoksetin antidepresan ının insanlar için genotoksik risk
oluşturup olu şturmadığını, insan periferal kan lenfositlerinde eksojen metabolik
aktivatör yoklu ğunda ve varl ığında in vitro karde ş kromatid de ğişimi (KKD),
kromozom anormalliği (KA) ve mikronukleus (MN) testleri ile belirlemek amac ıyla
yürütülmüştür. Hücreler, eksojen metabolik aktivatör yoklu ğunda 24 ve 48 saat,
eksojen metabolik aktivatör varl ığında ise 3 saat boyunca 8, 12, 16 ve 20µg/ml
Fluoksetin ile muamele edilmişlerdir.
Fluoksetin, insan periferal kan lenfositlerinde metabolik aktivatörün
bulunmadığı ve bulundu ğu durumda KKD’yi uyarmam ıştır. Halbuki Fluoksetin
metabolik aktivatörün yoklu ğunda KA olu şumunu hem 24 hem de 48 saatlik
muamelelerde kontrole nazaran uyarm ıştır. Metabolik aktivatörün varl ığında ise en
düşük konsantrasyon hariç KA’y ı uyarmıştır. Ayrıca Fluoksetin eksojen metabolik
aktivatörün yokluğunda 24 saatlik muamelede sadece en yüksek konsantrasyonda, 48
saatlik muamelede ise 12µg/ml konsantrasyonda MN olu şumunu artırmış, en yüksek
iki konsantrasyonda ise yeterli sayıda iki nukleuslu hücre bulunamamıştır. Metabolik
aktivatörün bulunduğunda ise Fluoksetin sadece en yüksek konsantrasyonda MN
oluşumunu uyarmıştır. Fluoksetin metabolik aktivatör yoklu ğunda 24 ve 48 saatlik
muamelede PI’yi dü şürmemiş, MI’yi ise 24 saatlik muamelede sadece en yüksek
konsantrasyonda, 48 saatlik muamelede ise en yüksek üç konsantrasyonda kontrole
nazaran düşürmüştür. Halbuki Fluoksetin NBI’yı 24 saatlik muamelede düşürmemiş,
48 saatlik muamelede ise 8, 12 ve 16µg/ml konsantrasyonlarda kontrole nazaran
düşürmüştür. Metabolik aktivatörün varl ığında ise Fluoksetin PI, MI ve NBI’yi
düşürmemiştir.

Anahtar Kelimeler: Fluoksetin, İnsan Periferal Kan Lenfositi, Karde ş Kromatid
Değişimi (KKD), Kromozom Anormalli ği (KA),
Mikronukleus (MN)
I
ABSTRACT

MSc THESIS

IN VITRO GENOTOXIC EFFECTS OF FLUOXETINE ON HUMAN
PERIPHERAL LYMPHOCYTES

Fezel NİZAM

ÇUKUROVA UNIVERSITY
INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT OF BIOLOGY

Supervisor :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTA Ş
Year :2010, Pages: 111
Jury :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTA Ş
Prof. Dr. Rü ştü HATİPOĞLU
Assoc. Prof. Dr. Hasan Basri İLA

The aim of the present study was to investigate the genotoxic effects of
Fluoxetine, on human peripheral lymphocytes by using sister chromatid exchange
(SCE), chromosomal aberration (CA) and micronucleus (MN) tests in absence and
presence of metabolic activation system. Cells were treated with 8, 12, 16, 20 µg/ml
Fluoxetine for 24 and 48 hours in the absence of a metabolic activation system and 3
hours in the presence of a metabolic activation system.
Fluoxetine did not induce SCEs in human peripheral blood lymphocytes both
in the absence and presence of the metabolic activator. Whereas Fluoxetine induced
CA formation when compared to control for 24-h and 48-h treatment periods in the
absence of metabolic activator. In case of metabolic activator presence, fluoxetine
induced CA in all concentrations except the lowest concentration. Additionally,
Fluoxetine increased MN formation only in highest dose in 24-h treatment and
12µg/ml concentration in 48-h treatment in the absence of metabolic activator. Also
in highest two concentrations of 48-h treatment period, enough number of binuclear
cells could not count. In case of metabolic activator presence, Fluoxetine induced
MN formation only in the highest concentration. In 24-h and 48-h treatment periods
Fluoxetine did not decrease PI, but in other hand it decreased MI compared to control
only in highest concentration in 24-h treatment and in three highest concentrations in
48-h treatment period. Whereas in 24-h treatment Fluoxetine did not decrease NDI
and in 48-h treatment in 8, 12 and 16 µg/ml concentrations Fluoxetine decreased
NDI compared to control. On the other hand Fluoxetine did not decrease PI, MI and
NDI in the presence of metabolic activator.

Key words: Fluoxetine, Human Peripheral Blood Lymphocytes, Sister Chromatid
Exchange (SCE), Chromosom Aberration (CA), Micronucleus (MN)

II
TEŞEKKÜR

Tez çalışmalarım sırasında bana her aç ıdan destek olan, yard ımlarını hiçbir
zaman esirgemeyen ve ki şisel gelişimimde sonsuz sab ır gösteren dan ışman hocam
sayın Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ’a en içten teşekkürlerimi sunarım.
Çalışmalarım esnasında, her konuda çok büyük yard ımlarını gördüğüm sayın
hocam Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI’na teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez
çalışmalarım sırasında yine çok büyük yardımlarını gördüğüm, Doç. Dr. Hasan Basri
İLA’ya, Arş. Gör. Erman Salih İSTİFLİ’ye, Arş. Gör. Burak KOÇAK’a, Biyolog
Mehmet BÜYÜKLEYLA’ya, Biyolog Mehmet ARSLAN’a, Biyolog Nadire
KOPAR’a, Biyolog A. Mine YILDIZ’a ve Biyolog Handan ERBO ĞA’ya teşekkür
ederim.
Çalışmalarım sırasında desteklerini benden esirgemeyen ve her ko şulda
yanımda yer alan aileme ve arkadaşlarıma da teşekkürü bir borç bilirim.
Ayrıca, bu yüksek lisans çal ışmasını maddi yönden destekleyen Ç.Ü.
Bilimsel Ara ştırma Projeleri Birimi yöneticilerine de te şekkür ederim (Proje
no:FEF2009YL57).

III
İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ…………………………………………….........................................................I
ABSTRACT………………………………………………………………………...II
TEŞEKKÜR………………………………………………………………..……....III
İÇİNDEKİLER…………………………………………………………………….IV
ÇİZELGELER DİZİNİ…………………………………………………….……….X
ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………...……......XII
SİMGELER VE KISALTMALAR……………………………………………...XVI
1.GİRİŞ……………………………………………………………………………...1
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR……………………………………………………….11
2.1.Seçici Serotonin Gerial ım İnhibitörü (SSGİ) Grubu Antidepresanlar İle
Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları………………………..11
2.1.1.Fluoksetin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları…..11
2.1.2.Fluvoksamin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları……………………………………………………………. 14
2.1.3.Paroksetin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları……………………………………………………………. 15
2.1.4.Sertralin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları……………………………………………………………..16
2.1.5.Sitalopram İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları……………………………………………………………..17
2.1.6.Venflaksin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları…………………..... 17
2.2.Monoamin Oksidaz İnhibitörü (MAOİ) Grubu Antidepresanlar İle Yapılan
Genotoksisite Çalışmaları……………………………………………........... 18
2.2.1.Fenelzin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………………… 18
2.2.2.İproniazid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları…………………….. 18
2.2.3.İzokarboksazid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………….. 19
2.2.4.Moklobemid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………….......19
2.2.5.Mebanazin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları………………….….19
2.2.6.Nialamid ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları………………………20
IV
2.2.7.Selejilin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………………......20
2.2.8.Tranilsipramin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları………………....20
2.3.Trisiklik Antidepresan (TSA) Grubu İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları. 20
2.3.1.Amitriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları………………….. 21
2.3.2.Desipramin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları……………………………………………………………. 22
2.3.3.Doksepin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları…………………...... 24
2.3.4.İmipramin İle Yapılan Genotoksisite, Sitotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları……………………………………………………………. 24
2.3.5.Karbamazepin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………...... 26
2.3.6.Klomipramin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite
Çalışmaları…………………………………………………….……… 27
2.3.7.Nortriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………….…... 28
2.3.8.Protriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları…………………… 28
2.4.Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörü (SNGİ)………………………...... 28
2.4.1.Maprotilin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………………. 28
2.4.2.Reboksetin ile Yapılan Toksisite Çalışmaları……………….….......... 29
2.5.Alfa 2 Adrenoreseptor Antagonistleri………………………………………. 29
2.5.1.Mianserin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları…………………….. 29
2.6.Serotonerjik ve Norepinefrin Gerialım İnhibitörleri……………………....... 29
2.6.1.Duloksetin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları……………………. 29
2.7.Antidepresanlarla Yap ılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmalarının
Sonuçlarının Özet Olarak Açıklanması……………………………….......... 29
3.MATERYAL VE METOD……………………………………………………... 31
3.1.Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları…………………….. 31
3.1.1.Antidepresanlar ve S ınıflandırması………………………………....... 31
3.1.1.1.Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörleri (SSGİ)………………. 31
3.1.1.2.Monoamin Oksidaz İnhibitörleri (MAOI)……………………. 32
3.1.1.3.Trisiklik Antidepresanlar (TSA)…………………………….....32
3.1.1.4.Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörleri (NGİ)…………… 33
3.1.1.5. α-2 Adrenoreseptör Antagonistleri………………………….....33
V
3.1.1.6.Serotonin-Noradrenerjik (Norepinefrin) Gerial ım İnhibitörleri
(SNGİ)………………………………………………… ……....34
3.1.1.7.Norepinefrin-Dopamin Gerial ım İnhibitörleri (NDGİ)............. 34
3.1.1.8.Etki Art ırıcı Antidepresan İlaçlar ……………………………. 34
3.1.1.1.(1).Seçici Serotonin Geri-Alım İnhibitörlerinin Etki
Mekanizması……………………………………… 35
3.1.1.1.(2).Seçici Serotonin Geri-Alım İnhibitörlerinin Yan
Etkileri……………………………………………. 35
3.1.2.Kullanılan Kimyasal Maddeler……………………………………....... 36
3.1.2.1.Fluoksetin ve Kimyasal Özellikleri…………………………… 36
3.1.2.1.(1).Fluoksetin’in Farmakokinetik Özellikleri………… 37
3.1.2.1.(2).Fluoksetin’in Kimyasal Yap ısı……………………. 37
3.1.2.2.5'-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd) (Sigma)………………… 38
3.1.2.3.Cyclophosphamide monohydrate (Sigma)………………......... 38
3.1.2.4.Cytochalasin B (Sigma)……………………………………..... 39
3.1.2.5.Entellan (Merck)……………………………………………… 39
3.1.2.6.Fiksatif………………………………………………………... 39
3.1.2.7.Giemsa (Merck)……………………………………………..... 40
3.1.2.8.Hipotonik Eriyik……………………………………………… 40
3.1.2.9.Karaciğerin Alınması ……………………………………….... 40
3.1.2.10.Karaciğer Homojenat S9 Fraksiyonlarının Hazırlanması….... 41
3.1.2.11.Kolkisin (Kol şisin) (Sigma)…………………………………. 42
3.1.2.12.Kromozom Medyumu……………………………………….. 43
3.1.2.13.Mitomycin C (MMC) (Sigma)………………………………. 43
3.1.2.14.Nitrik Asit (HNO )………………………………………….. 44
3
3.1.2.15.RPMI1640 Besi Yeri…………………………....................... 44
3.1.2.16.Sıçan Karaciğer Enzimlerinin İndüklenmesi………………....44
3.1.2.17.Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer)………………………. 45
3.1.2.18.Standart S9 mix (Memeli Karaciğer Fraksiyonu [S9] )……... 45
3.1.2.19.Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği……………………….. 45
3.1.3.Kullanılan Deney Ekipmanları……………………………………...... 46
VI
3.1.3.1.Flow Kabin (Steril Kabin)……………………………………..46
3.1.3.2.Hassas Terazi…………………………………………………. 46
3.1.3.3.İnkübatör…………………………………………………….... 46
3.1.3.4.Mikroskop…………………………………………………….. 46
3.1.3.5.Otoklav………………………………………………………... 46
3.1.3.6.pH Metre…………………………………………………….... 47
3.1.3.7.Santrifüj………………………………………………………. 47
3.1.3.8.Su Banyosu …………………………………………………....47
3.2.Lamların Temizlenmesi……………………………………………………... 47
3.3.Sterilizasyon…………………………………………………………………. 47
3.3.1.BrdUrd Eriyiğinin Sterilizasyonu……………………………………... 47
3.3.2.Cyclophosphamide monohydrate’nin Sterilizasyonu………….…….... 48
3.3.3.Saf Suyun Sterilizasyonu…………………………………………........ 48
3.4.Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange= SCE) ve
Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosome Aberration=CA)
Saptamak Amac ıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların
Haz ırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İnceleme………………………. 48
3.4.1.Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması
(S9 mix’siz test)………………………………………………………. 49
3.4.2.Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması
(S9 mix’li test)………………………………………………………...50
3.4.3.Preparatların Boyanması ve Daimi Preparatların Hazırlanması……… 51
3.4.4.Daimi Preparatlarda Mikroskobik İnceleme………………………...... 52
3.4.4.1.KKD Sayısının ve Proliferasyon İndeksinin (PI)
(Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması………………………..52
3.4.4.1.(1).KKD Say ısının Saptanması……………………......52
3.4.4.1.(2).Proliferasyon İndeksi (PI) (Replikasyon
İndeksi=RI)’nin Saptanması………………………53
3.4.4.2.Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI)
Saptanması……………………………………………………. 58
VII
3.4.4.2.(1).Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin
Saptanması………………………………………....58
3.4.4.2.(2).Mitotik İndeksin (MI) Saptanması………...............59
3.5.Mikronukleus (MN) Olu şumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün
Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik
İncelemeler………………………………………………………………….. 59
3.5.1.Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması
(S9 mix’siz test)…………………………………….………………….59
3.5.2.Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması
(S9 mix’li test)………………………………………………………....60
3.5.3.Preparatların Boyanması………………………………………............. 61
3.5.4.Mikronukleus Testi İçin Hazırlanan Preparatlarda Mikroskobik
İnceleme………………………………………………………………. 61
3.5.4.1.Mikronukleus Sayısı ve Nukleus Bölünme İndeksinin (NBI)
Saptanması………………………………………………..........61
3.6.Mikroskopta Fotoğraf Çekme………………………………………............. 65
3.7.İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi……………………….. 65
4.BULGULAR VE TARTIŞMA…………………………………………………. 67
4.1.Bulgular……………………………………………………………………..67
4.1.1.Fluoksetin’in Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunmayan Ortamda
İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri…………....67
4.1.1.1.Fluoksetin’in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki
Etkileri………………………………………………………....67
4.1.1.2.Fluoksetin’in Kromozom Anormallikleri (KA) Oluşumu
Üzerindeki Etkileri………………………………………......... 68
4.1.1.3.Fluoksetin’in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme
Üzerindeki Etkileri………………………………………......... 74
4.1.1.4.Fluoksetin’in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus
Bölünmesi Üzerindeki Etkileri…………………………….......78
4.1.2.Fluoksetin’in Eksojen Metabolik Aktivatör (S9 mix) Bulunan
Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri….81
VIII