Cryopreservation of Jiangxi Yanshan Red Bud Taro (Colocasia esculenta var. cormosus cv. Hongyayu) Embryogenic Calli by Encapsulationdehydration PDF
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植 物 分 类 与 资 源 学 报 ꎬ３６ ( ): ２０１４ ４ ５０５~５１２ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ : ＤＯＩ １０.７６７７/ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３１８１ 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存 ∗ 洪森荣ꎬ 尹明华∗∗ꎬ 王艾平 上饶师范学院生命科学学院 江西上饶 ( ꎬ ３３４００１) 摘要: 对江西铅山红芽芋 Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｃｏｒｍｏｓｕｓ 胚性愈伤组织包埋干燥法超低温 ( ｖａｒ. ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) 保存进行了初步的研究 结果表明 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超低温保存较佳的条件为 ꎮ : : －１蔗糖预培养 脱水方式为空气干燥 或硅胶干燥 化冻温度为 冻后 ０７５ｍｏｌＬ ３ｄꎻ ７ｈ １１ｈꎻ ３７℃ (２ｍｉｎ)ꎻ 培养条件为暗培养 再转到光周期中培养 此方法超低温保存后的平均成活率约为 超低温保存时 ７ｄ ꎮ ４５％ꎮ 间以及是否去除包裹的褐藻酸钙对其成活率无显著性影响 形态学和细胞学检测表明红芽芋胚性愈伤组织 ꎮ 冻后再生苗与母本材料相比没有发生变异 ꎮ 关键词: 江西铅山红芽芋 胚性愈伤组织 包埋干燥法 超低温保存 ꎻ ꎻ ꎻ 中图分类号: 文献标识码: 文章编号: Ｑ９４３１ꎬ Ｓ６３２３ Ａ ２０９５－０８４５(２０１４)０４－５０５－０８ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ Ｒｅｄ Ｂｕｄ Ｔａｒｏ Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ( ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｖａｒ. ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ) Ｃａｌｌｉ ｂｙ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ∗∗ ＨＯＮＧ Ｓｅｎ￣Ｒｏｎｇꎬ ＹＩＮ Ｍｉｎｇ￣Ｈｕａ ꎬ ＷＡＮＧ Ａｉ￣Ｐｉｎｇ ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ ＳｈａｎｇｒａｏＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ( ꎬ ꎬＳｈａｎｇｒａｏ３３４００１ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｃｏｒｍｏｓｕｓ : Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｙａｎｓｈａｎ ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ ( ｖａｒ. ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) ｅｍ￣ ｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ. Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ －１ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ＭＳ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ０７５ｍｏｌＬ ｓｕ￣ ｃｒｏｓｅ ｆｏｒ３ ｄａｙｓ. Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｂｙｓｔｅｒｉｌｅａｉｒｉｎａｌａｍｉｎａｒｆｌｏｗｈｏｏｄｆｏｒ７ｈｏｒｓｔｅｒ￣ ｉｌｅ ｄｒｙ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｆｏｒ１１ｈ. ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｈａｗｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３７℃ (２ｍｉｎ). Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ －１ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｈｅｄａｒｋｆｏｒ７ｄａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏｔｈｅｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｏｆ１４ｈｄ . Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｓｕｒｖｉｖ￣ ａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ４５％. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ. Ｍｏｒ￣ ｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｂｌｅ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｃｏｒｍｏｓｕｓ : Ｒｅｄ ｂｕｄ ｔａｒｏ ( ｖａｒ. ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ)ꎻ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓꎻ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎꎻ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ 芋具有较丰富的营养价值 在当今蔬菜消 ｃｏｒｍｏｓｕｓ 是江西省铅山县传统优 ꎬ ｃｖ. Ｈｏｎｇｙａｙｕ) 费市场中占有重要地位 是我国南方主要的蔬菜 势产品 种植历史悠久 近十余年来 这一优势 ꎬ ꎬ ꎮ ꎬ 种类 红芽芋 Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ 产业发展迅速 已成为铅山县农民增收致富的主 ꎮ ( Ｌ. Ｓｃｈｏｔｔ ｖａｒ. ꎬ 基金项目 江西省科技厅 年农业科技支撑项目基金 年度江西省高等学校科技落地计划项目 ∗ : ２０１２ (２０１２２ＢＢＦ６０１２６)ꎻ ２０１３ (ＫＪＬＤ１３０８８) 通讯作者 ∗∗ : ＡｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｙｉｎｍｉｎｇｈｕａ０４＠１６３ｃｏｍ 收稿日期 接受发表 : ２０１３－０９－１０ꎬ ２０１３－１１－０１ 作者简介 洪森荣 男 硕士 副教授 研究方向 植物组织培养 : (１９７４－) ꎬ ꎬ ꎬ : ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｈｏｎｇｓｅｎｒｏｎｇ＠１６３ｃｏｍ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ５０６ ３６ 导产业 铅山县也成为江西省最大的红芽芋生产 存江西铅山红芽芋种质资源提供技术基础 ꎬ ꎮ 基地 年获国家无公害绿色食品证书 ꎬ ２００２ ꎬ ２００７ 年 月被中国绿色食品委员会和农业部命名为 １ 材料和方法 ３ 红芽芋全国绿色食品标准化生产基地县 其产 １１ 材料 “ ”ꎬ 品不但热销上海 广东 浙江 湖北 山东等地 江西铅山红芽芋脱毒试管苗 由江西省江天农业科 、 、 、 、 ꎬ ꎬ 而且远销日本 韩国 新加坡等国 郑建平 技有限公司提供 、 、 ( ꎬ ꎮ １２ 方法 李火金 红芽芋中碳水化合物含 ２０１０ꎻ ꎬ ２０１２)ꎮ 胚性愈伤组织诱导 将江西铅山红芽芋脱毒试管 量较高 脂肪含量较低 蛋白质 维生素及矿物 １２１ ꎬ ꎬ 、 苗的小球茎横切成 厚 分别接种到诱导培养基 质元素含量丰富 营养价值高 具有良好的食用 １~２ｍｍ ꎬ ꎬ ꎬ 上 诱导培养基为 －１ －１ 价值和开发前景 姜绍通等 目前 传 ꎮ ＭＳ＋ＴＤＺ２ｍｇＬ ＋２ꎬ４￣Ｄ１ｍｇＬ ꎬ ( ꎬ ２０１２)ꎮ ꎬ 并添加 －１蔗糖和 －１琼脂 光照 统的江西铅山红芽芋种质资源保存仍采用大田种 ３０ｇＬ ７ｇＬ ꎬ ｐＨ５８~６０ꎮ 条件 黑暗 温度 每天观察愈伤组织诱 : ꎻ : (２５±１) ℃ꎮ 植的方法 不仅需要大量的人力 物力和财力 导情况 记录愈伤组织出现的时间 出愈数 愈伤组织 ꎬ 、 ꎬ ꎬ 、 、 而且还不可避免地受到各种自然灾害 如病虫 颜色和愈伤组织生长情况 后 选取浅黄色果冻状 ( ꎮ ６０ｄ ꎬ 害 干旱 低温等 和人为失误 疏于管理 的胚性愈伤组织继代 次 每次 然后将其应用于 、 、 ) ( 、 ２ ꎬ ３０ｄꎬ 挂错标签等 的影响 最终可能造成特有种质的 包埋干燥法超低温保存实验 ) ꎬ ꎮ 遗失或混杂 因此 探索江西铅山红芽芋种质资 胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存程序 在 １２２ ꎮ ꎬ 下 将约 的红芽芋胚性愈伤组织块转入 源超低温保存的方法具有十分重要的意义 (２５±１)℃ ꎬ ０２ｇ 胚性愈伤组织是原生质体操作中最为ꎮ重要的 含２％褐藻酸钠和１ｍｏｌＬ－１蔗糖的ＭＳ培养基中ꎬ 然后 将包含胚性愈伤组织的混合物滴入含有 －１ 原始材料 无论是原生质体培养再生植株还是经 ０１ ｍｏｌＬ ꎬ 和 －１蔗糖的 液体培养基中 以充 原生质体融合获得体细胞杂种 都离不开胚性愈 ＣａＣｌ２ １ｍｏｌＬ ＭＳ ３０ｍｉｎꎬ ꎬ 分形成直径约 的球形包埋珠 每个包埋珠含 个 ４ｍｍ ꎮ １ 伤组织的诱导和保存 曾博雅等 然而 胚性愈伤组织块 在无菌条件下 取出包埋珠 放入 ( ꎬ ２００９)ꎮ ꎬ ꎮ ꎬ ꎬ 胚性愈伤组织在长期继代培养过程中经常丢失潜 无菌三角瓶内 倒入 －１ １００ｍＬ ꎬ ＭＳ＋ＴＤＺ ２ｍｇＬ ＋ＮＡＡ １ 在的形态发生能力 从而增加了遗传学上的不稳 －１ 无蔗糖 液体培养基进行洗涤 洗涤后将包埋 ꎬ ｍｇＬ ( ) ꎬ 定性 因此 胚性愈伤组织的长期保存是人们一 珠夹出用无菌滤纸片吸干后 将包埋珠转入 ꎮ ꎬ : (１) ＭＳ＋ 直试图解决的问题 超低温保存是胚性愈伤组织 －１ －１ －１蔗糖的液体 ꎬ ＴＤＺ２ｍｇＬ ＋ＮＡＡ１ｍｇＬ ＋ ０~１ｍｏｌＬ 培养基中 预培养 或者将包埋珠转入 长期保存的一种常用方法 植物的胚性愈伤组织 ꎬ ３ｄꎻ (２) ＭＳ＋ＴＤＺ ꎮ 如能成功地保存在液氮中 则可为生物工程研究 ２ｍｇＬ－１＋ＮＡＡ１ｍｇＬ－１＋ ０７５ｍｏｌＬ－１蔗糖的液体培养 ꎬ 基中 预培养 预培养条件均为 光照时间 提供全能性原生质体 也可为植物转基因技术提 ꎬ ０~７ｄꎮ : : １４ｈ ꎬ －１ 光照强度 －２ －１ 温度 供良好受体材料 ｄ ꎻ : １２５~２５μｍｏｌｍ ｓ ꎻ : (２５± ꎮ 预培养后 包埋珠表面迅速用灭菌滤纸干燥 放 包埋干燥法最早出现在法国学者 和 １) ℃ꎮ ꎬ ꎬ Ｆａｂｒｅ Ｄｅ￣ 置在装有灭菌滤纸的培养皿 直径 中 在室温下 ( ９ｃｍ) ꎬ 超低温保存马铃薯茎尖的研究中 采用超净工作台的层流空气脱水 或者在含有无 ｒｅｕｄｄｒｅ (１９９０) ꎮ ０~１０ｈꎻ 包埋干燥法具有样品易于操作 避免了二甲基亚 菌干燥硅胶的带硅胶塞的 密闭三角瓶中脱水 、 １００ｍＬ ０~ 砜和程序降温仪的使用 王君晖等 目前 每干燥脱水 后 均取 个包埋珠进行称重 ( ꎬ １９９９)ꎮ １５ｈꎮ １ ｈ ꎬ １５ : 该技术已应用于长春花 等 啤 包埋珠放在烘箱中 干燥 后测其含水量 以 小 (Ｂａｃｈｉｒｉ ꎬ １９９５)、 ８０℃ ２ｄ ꎬ ( 酒花 等 葡萄 等 珠鲜重 干重 鲜重的百分数表示 取脱水包埋珠转移 － )/ ꎮ (Ｍａｒｔｉｎｅｚ ꎬ １９９９)、 (Ｗａｎｇ ꎬ 到 冻存管中 然后将冻存管迅速置于液氮中保存 苜蓿 等 大叶蝴蝶兰 ２ｍＬ ꎬ １ｄꎮ ２０００)、 (Ｓｈｉｂｌｉ ꎬ ２００１)、 从液氮中取出冷冻管 分别放入温度为 等 冬凌草 等 阿拉 ꎬ ２５ ℃、 ３０ ℃、 (Ａｍｉｒ ꎬ ２０１１)、 (Ａｉ ꎬ ２０１２)、 或 的水浴中化冻 伯艾蒿 等 苹果 等 ３７℃ ４２℃ ３ｍｉｎꎮ (Ｓａｒａｂ ꎬ ２０１２)、 (Ｆｅｎｇ ꎬ 胚性愈伤组织恢复培养及成活率检测 将化冻后 等植物的超低温保存中 目前 国内外 １２３ ２０１３) ꎮ ꎬ 去除或不去除褐藻酸钙的红芽芋胚性愈伤组织块转入分 尚未见有关包埋干燥法超低温保存红芽芋胚性愈 化培养基 －１ －１ －１ (ＭＳ＋ＴＤＺ２ｍｇＬ ＋ＮＡＡ１ｍｇＬ ＋３０ｇＬ 伤组织的报道ꎮ 本实验建立了红芽芋胚性愈伤组 蔗糖＋７ｇＬ－１琼脂) 中ꎬ 然后置于两种培养条件下进行 织的包埋干燥法超低温保存体系 为长期稳定保 恢复培养 一是将化冻后的红芽芋胚性愈伤组织块直接 ꎬ ꎮ 期 洪森荣等 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存 ４ : ５ ０７ 置于光周期中培养 光照时间 －１ 光照强度 是层流空气脱水还是干燥硅胶脱水 两者的最高 [ : １４ ｈｄ ꎻ : ꎬ －２ －１ 温度 另一种 成活率无显著性影响 但其脱水时间对红芽芋胚 １２５~２５μｍｏｌｍ ｓ ꎻ : (２５± １) ℃)]ꎻ ꎬ 是先将化冻后的红芽芋胚性愈伤组织块暗培养 温 性愈伤组织包埋干燥法超低温保存还是具有显著 ７ｄ [ 度 再转到光周期中培养 光照时间 : (２５± １) ℃]ꎬ [ : 影响 结果表明 当层流空气脱水时间超过 －１ 光照强度 －２ －１ 温度 ꎮ ꎬ ４ ｈ １４ｈｄ ꎻ : １２５~２５μｍｏｌｍ ｓ ꎻ : ２５ 或干燥硅胶脱水时间超过 时 红芽芋胚性愈 后统计成活率及恢复生长的时间 红芽 ７ ｈ ꎬ ±１℃)]ꎮ ６０ｄ ꎮ 伤组织开始出现冻后成活 而且随着脱水时间的 芋胚性愈伤组织块的成活以其能分化出胚状体为标志 ꎬ ꎮ 延长 冻后成活率均显著增加 当层流空气脱水 成活率 超低温保存后胚性愈伤组织分化出胚状体的块 ꎬ ꎻ ＝( 或干燥硅胶脱水 即含水量为 数 超低温保存后胚性愈伤组织的总块数 / )×１００％ꎮ ７ｈ １１ ｈ ( ２１２％~ 超低温保存后胚性愈伤组织再生苗的形态学和细 时 红芽芋胚性愈伤组织的冻后成活率 １２４ ２１５％) ꎬ 胞学检测 将超低温保存后的红芽芋胚性愈伤组织块以 达到 之后随着干燥时间的增 ４４６％~４５２％ꎻ 及未进行超低温保存处理的红芽芋胚性愈伤组织块 加 冻后成活率下降 因此 红芽芋胚性愈伤组 ꎬ ꎮ ꎬ 约 同时接入分化培养基 织包埋干燥法超低温保存的适宜干燥时间为层流 (ＣＫꎬ ０２ｇ) (ＭＳ＋ＴＤＺ ２ｍｇ Ｌ－１＋ＮＡＡ１ｍｇＬ－１＋３０ｇＬ－１蔗糖＋７ｇＬ－１琼脂)ꎬ ３０ｄ 空气脱水 或干燥硅胶脱水 ７ｈ １１ｈꎮ 后将分化出的胚状体再次转入分化培养基 (ＭＳ＋ＴＤＺ ２ ２３ 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥 －１ －１ －１蔗糖 －１琼脂 ｍｇＬ ＋ＮＡＡ １ｍｇＬ ＋３０ｇＬ ＋７ｇＬ )ꎬ 法超低温保存的影响 形成完整植株后对以上两种再生苗进行形态学和细 ６０ｄ 从表 可知 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组 胞学检测 形态学检测指标有株高 芽数 根数 根长 ３ ꎬ ꎮ 、 、 、 织包埋脱水法超低温保存具有显著影响 用 等 细胞学检测采用染色体数目测定与观察的方法 梁 ꎮ ꎮ ( 乾隆等 －１蔗糖预培养 后 在含有干燥硅 ꎬ２０１３)ꎮ ０７５ｍｏｌＬ ３ｄ ꎬ 统计方法 以上实验均重复 次 每次实验的 表１ 预培养液中蔗糖浓度对红芽芋胚性愈伤组织 １２５ ３ ( 样本量均为 个 本实验所有数据表示为 ＳＤ 包埋脱水法超低温保存的影响 ４５ )ꎬ Ｍｅａｎ± ꎬ 由于统计各处理的细胞活力和成活率时发现多数实验数 Ｔａｂｌｅ１ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ 据不在 范围内 为提高显著性检验的精确度 ３０％~７０％ ꎬ ꎬ ｏｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ 对其进行反正弦转换 然后用 软件进行 ꎬ ＳＰＳＳ１９０ Ｏｎｅ￣ ｃａｌｌｕｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ 分析 再进行 法检验 Ｐ 为有统 蔗糖浓度 成活率 Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ꎬ ＬＳＤ ꎬ <００５ 计学差异显著性ꎮ Ｓｕｃｒｏｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ/ｍｏｌＬ－１ Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ/％ ０ １２６±６３Ｃｄ ２ 结果与分析 ０２５ ２５８±８２Ｂｃ ０５ ２９４±６４Ｂｂｃ ２１ 预培养对红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法 ０７５ ４６９±７５Ａａ 超低温保存的影响 １ ３２５±３２Ｂｂ 注 同一列中大 小写字母分别表示在 和 水平上的 从表 可知 预培养对红芽芋胚性愈伤 : 、 ００１ ００５ １~２ ꎬ 差异性 下同 组织包埋脱水法超低温保存具有显著影响 当用 ꎬ ꎮ Ｎｏｔｅ:Ｔｈｅｃａｐｉｔａｌａｎｄ ｓｍａｌｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖｏｌｕｍｅ ｓｔａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ －１蔗糖对红芽芋胚性愈伤组织预培养 ０~１ｍｏｌＬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎ００１ａｎｄ００５ｌｅｖｅｌꎬｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ 或用 －１蔗糖对红芽芋胚性愈伤组 ３ｄ ０７５ ｍｏｌＬ 表２ 预培养时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋 织预培养 时 结果表明 红芽芋胚性愈伤 ０~７ｄ ꎬ ꎬ 脱水法超低温保存的影响 组织包埋干燥法超低温保存的最适宜预培养条件 Ｔａｂｌｅ２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｏｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｄ￣ 为 －１蔗糖预培养 蔗糖浓度过高 ０７５ｍｏｌＬ ３ ｄꎬ ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ 过低或预培养时间过长 过短均不利于红芽芋胚 预培养时间 成活率 、 性愈伤组织的冻后成活 Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ/ｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ/％ ꎮ ２２ 干燥方式和时间对红芽芋胚性愈伤组织包 ０ １３８±３９Ｄｄ 埋干燥法超低温保存的影响 １ ３５４±５２Ｃｃ ３ ４８２±４２Ａａ 从图 和 可知 脱水方式对红芽芋胚性愈 １ ２ ꎬ ５ ４０９±４６Ｂｂ 伤组织包埋干燥法超低温保存无显著影响 无论 ７ ３４８±８２Ｃｃ ꎮ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ５０８ ３６ 图 干燥硅胶脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋珠含水量的影响大 小写字母分别 １ 、 表示在 和 水平上的差异性 下同 ００１ ００５ ꎬ Ｆｉｇ１ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｄｒｙｓｉｌｉｃａ￣ｇｅｌｏｎｔｈｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｏｆｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｂｅａｄｓ Ｔｈｅｃａｐｉｔａｌａｎｄｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｓｔａｎｄｆｏｒｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｎ００１ａｎｄ００５ｌｅｖｅｌꎬｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ 图 层流空气脱水时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋珠含水量的影响 ２ Ｆｉｇ２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｉｎｌａｍｉｎａｒａｉｒｆｌｏｗｏｎｔｈｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｏｆｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｂｅａｄｓ 表３ 化冻温度对红芽芋胚性愈伤组织包埋 胚性愈伤组织进行化冻时 结果表明 江西铅山 ꎬ ꎬ 脱水法超低温保存的影响 红芽芋胚性愈伤组织包埋脱水法超低温保存的适 Ｔａｂｌｅ３ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈａｗｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｄ￣ 宜化冻温度为 ３７℃ꎮ ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ２４ 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋 化冻温度 成活率 干燥法超低温保存的影响 Ｔｈａｗｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ/℃ Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ/％ 从表 可知 冻后培养条件对红芽芋胚性愈 ２５ ２０４±５３Ｃｃ ４ ꎬ ３０ ３２６±４２Ｂｂ 伤组织包埋脱水法超低温保存具有显著影响 包 ꎮ ３７ ４７４±６８Ａａ 埋珠用 －１蔗糖预培养 后 在含有 ０７５ｍｏｌＬ ３ ｄ ꎬ ４２ ３５２±３９Ｂｂ 干燥硅胶的密闭容器中脱水 至含水量为 １１ ｈ 胶的密闭容器中脱水 至含水量为 时 时 投入液氮保存 后 将包埋珠取出 １１ ｈ ２１１％ ꎬ ２１１％ ꎬ １ｄ ꎬ ꎬ 投入液氮保存 后 将包埋珠取出 用温度为 用温度为 的水浴对红芽芋冻后胚性愈伤组 １ｄ ꎬ ꎬ ３７℃ 或 的水浴对红芽芋冻后 织进行化冻 然后直接置于光周期中培养或先暗 ２５℃、 ３０℃、 ３７℃ ４２℃ ꎬ 期 洪森荣等 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存 ４ : ５ ０９ 培养 再转到光周期中培养时 结果表明 冻 存 后 将包埋珠取出 用温度为 的水浴 ７ｄ ꎬ ꎬ １ｄ ꎬ ꎬ ３７℃ 后 的暗培养有助于提高其冻后成活率 对红芽芋冻后胚性愈伤组织进行化冻 然后将去 ７ｄ ꎮ ꎬ 表４ 冻后培养条件对红芽芋胚性愈伤组织包埋 除或保留褐藻酸钙的包埋珠先暗培养 再转到 ７ ｄ 脱水法超低温保存的影响 光周期中培养 从表 可知 培养物抽提即去除 ꎮ ６ ꎬ Ｔａｂｌｅ４ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｏｓｔｔｈａｗｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ 包裹的褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包埋脱水 ｏｆｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ 法超低温保存的成活率无显著影响 但促进其冻 冻后培养条件 成活率 ꎬ 后再生速度 Ｐｏｓｔｔｈａｗｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ/％ ꎮ 直接置于光周期下培养 表５ 超低温保存时间对红芽芋胚性愈伤组织包埋 ３６８±５４Ｂｂ Ｄｉｒｅｃｔｃｕｌｔｕｒｅｉｎｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ 脱水法超低温保存的影响 先暗培养 再置于光周期下培养 ７ｄ Ｔａｂｌｅ５ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆ Ｆｉｒｓｔｌｙｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄａｒｋｆｏｒ７ｄｔｈｅｎｉｎ ４５９±４９Ａａ ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ 超低温保存时间 成活率 Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ/ｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ/％ ２５ 超低温保存时间对红芽芋胚性愈伤组织包 １ ４２６±６３Ａａ 埋干燥法超低温保存的影响 ３０ ４９３±４９Ａａ 从表 可知 红芽芋胚性愈伤组织包埋珠用 ６０ ４５８±４２Ａａ ５ ꎬ －１蔗糖预培养 后 在含有干燥硅 ９０ ４８２±７２Ａａ ０７５ｍｏｌＬ ３ ｄ ꎬ 胶的密闭容器中脱水 至含水量为 时 １２０ ４２７±５４Ａａ １１ ｈ ２１１％ ꎬ １５０ ５１４±６１Ａａ 投入液氮保存 后 将包埋珠取出 用温 １~１８０ｄ ꎬ ꎬ １８０ ４３７±８２Ａａ 度为 的水浴对红芽芋冻后胚性愈伤组织进 ３７℃ 行化冻 然后先暗培养 再转到光周期中培养 ２７ 冻后胚性愈伤组织再生苗的形态学和细胞 ꎬ ７ ｄ 时 其冻后成活率虽有差异 但未达显著性水 学检测 ꎬ ꎬ 平 因此 超低温保存时间对红芽芋胚性愈伤组 从表 图 可知 红芽芋胚性愈伤组织 ꎮ ꎬ ７、 ３~７ ꎬ 织包埋干燥法超低温保存无显著影响 冻后再生苗与未冻后再生苗在形态指标上的差异 ꎮ ２６ 褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥 均未达显著性水平 Ｐ 而且 红芽芋胚 ( >００５)ꎮ ꎬ 法超低温保存的影响 性愈伤组织冻后再生苗与未冻后再生苗的染色体 红芽芋胚性愈伤组织包埋珠用 －１ 数目经检测未发生变化 以上结果表明 江西铅 ０７５ ｍｏｌＬ ꎮ ꎬ 蔗糖预培养 后 在含有干燥硅胶的密闭容器 山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存 ３ｄ ꎬ 中脱水 至含水量为 时 投入液氮保 可以保证其遗传稳定性 １１ｈ ２１１％ ꎬ ꎮ 表６ 褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包埋脱水法超低温保存的影响 (４２ｄ) Ｔａｂｌｅ６ ＥｆｆｅｃｔｏｆＣａ￣ａｌｇｉｎａｔｅｏｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ 平均新生芽长 平均新生芽数 褐藻酸钙 成活率 Ｃａ￣ａｌｇｉｎａｔｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ/％ Ａｖｅｒａｇｅｎｅｗｂｕｄｌｅｎｇｔｈ Ａｖｅｒａｇｅｎｅｗｂｕｄｎｕｍｂｅｒ 去除 Ｒｅｍｏｖｅ ４６３±２９Ａａ １３±０２Ａａ ３４±０８Ａａ 保留 Ｒｅｔａｉｎ ４５２±５１Ａａ １６±０４Ｂｂ １８±０５Ｂｂ 表７ 超低温保存后红芽芋胚性愈伤组织再生苗的形态学检测 Ｔａｂｌｅ７ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔｓｏｆｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｐｏｓｔｔｈａｗ 正常的胚性愈伤组织再生苗 冻后胚性愈伤组织再生苗 形态指标 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｄｅｘ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｐｏｓｔｔｈａｗ ｗｉｔｈｏｕｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ 平均株高 Ａｖｅｒａｇｅｐｌａｎｔｌｅｔｈｅｉｇｈｔ/ｃｍ ８２±１８Ａａ ７６±２３Ａａ 平均新生芽数 Ａｖｅｒａｇｅｎｅｗｂｕｄｎｕｍｂｅｒ ４２±０９Ａａ ３８±１５Ａａ 平均新生根数 Ａｖｅｒａｇｅｎｅｗｒｏｏｔｎｕｍｂｅｒ ５６±１３Ａａ ６３±２２Ａａ 平均根长 Ａｖｅｒａｇｅｒｏｏｔｌｅｎｇｔｈ/ｃｍ ６８±２１Ａａ ７９±１４Ａａ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ５１０ ３６ 图 红芽芋胚性愈伤组织冻后萌发 图 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生小苗 左为正常的胚性 ３ ４ ( 愈伤组织再生苗 右为冻后胚性愈伤组织再生苗 Ｆｉｇ３ Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｐｏｓｔｔｈａｗｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ꎬ ) ｃａｌｌｉｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｆｉｇ４ Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｐｏｓｔｔｈａｗｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｉｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ(Ｌｅｆｔｗａｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ ｗｉｔｈｏｕｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬｒｉｇｈｔｗａｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓｐｏｓｔｔｈａｗｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ) 图 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生小苗增殖 左为正常的胚性愈伤组织再生苗 右为冻后胚性愈伤组织再生苗 ５ ( ꎬ ) Ｆｉｇ５ Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｐｏｓｔｔｈａｗｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｉｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ(Ｌｅｆｔｗａｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｗｉｔｈｏｕｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬｒｉｇｈｔｗａｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｐｏｓｔｔｈａｗｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ) 图 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生小苗继代生长 左为正常 图 红芽芋胚性愈伤组织冻后再生植株移栽成活 左为正常 ６ ( ７ ( 的胚性愈伤组织再生苗 右为冻后胚性愈伤组织再生苗 的胚性愈伤组织再生苗 右为冻后胚性愈伤组织再生苗 ꎬ ) ꎬ ) Ｆｉｇ６ Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｐｏｓｔｔｈａｗｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｉｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｆｉｇ７ Ｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏｐｏｓｔｔｈａｗｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｉｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｇｒｏｗｔｈ(Ｌｅｆｔｗａｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓ ｐｌａｎｔｌｅｔｗｅｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｓｕｒｖｉｖａｌ(Ｌｅｆｔｗａｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔｗｉｔｈｏｕｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬｒｉｇｈｔｗａｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔｗｉｔｈｏｕｔｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬｒｉｇｈｔｗａｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｐｏｓｔｔｈａｗｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ) ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓｐｏｓｔｔｈａｗｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔ) 期 洪森荣等 江西铅山红芽芋胚性愈伤组织的包埋干燥法超低温保存 ４ : ５ １１ ３ 讨论 水 含水量为 时 可获得约 的成活 ４ｈꎬ １６％ ꎬ ８０％ 包埋干燥法是将样品用褐藻酸钙包埋和脱水 率 等 冬凌草茎尖在干燥硅 (Ｍａｒｔｉｎｅｚ ꎬ １９９９)ꎮ 后 投入液氮中保存的方法 该方法容易掌握 胶上脱水 含水量为 时 ꎬ ꎮ ꎬ ５~７ ｈꎬ ２１１％~２４２％ ꎬ 可缓和脱水过程 简化脱水程序 而且一次能处 可获得约 的成活率 等 枳橙 ꎬ ꎬ ８５％ (Ａｉ ꎬ ２０１２)ꎮ 理较多的材料 曾博雅等 在植物种质 Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ( ꎬ ２００９)ꎮ [ (Ｌ.) Ｒａｆ. × (Ｌ.) 资源的超低温保存中 包埋干燥法对物种的依赖 茎尖在无菌空气流中脱水 含水量 ꎬ Ｏｓｂｅｃｋ.] ８ ｈꎬ 性较低 适用范围很广 因此 得到人们的青 为 时 可获得约 的成活率 ꎬ ꎬ ꎬ １７１％ ꎬ ４０％ (Ｗａｎｇ 睐 近年来 包埋干燥法在植物种质保存中应用 等 长春花悬浮细胞在无菌空气流中脱 ꎮ ꎬ ꎬ ２００２)ꎮ 广泛 且发展迅速 不仅有更多的植物种类和种 水 含水量为 －１ 时 可获得约 ꎬ ꎬ ４ ｈꎬ ０３４ ｇｇ ＤＷ ꎬ 质类型采用此法保存获得成功 而且在保存技术 的成活率 等 阿拉伯艾蒿 ꎬ ５０％ (Ｂａｃｈｉｒｉ ꎬ １９９５)ꎮ 上也有了新的突破 通常包埋干燥法超低温保存 茎尖在无菌空气流中脱水 含水量为 ꎮ ４ｈꎬ １２５６％ 一般包括包埋 预培养 干燥脱水 化冻和再培 时 可获得约 的再生率 等 、 、 、 ꎬ ６％ (Ｓａｒａｂ ꎬ ２０１２)ꎮ 养等步骤 谷月等 苹果 Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ 茎尖在 ( ꎬ ２００７)ꎮ “Ｇａｌａ” ( × Ｂｏｒｋｈ.) 预培养一般指用高浓度的蔗糖预培养 预培 无菌空气流中脱水 含水量为 ꎬ ５~７ ｈꎬ ２０％~２２％ 养有利于保存细胞的生活力 提高材料的抗冻力 时 可获得 的成活率 等 ꎬ ꎬ ８０％ ~ ８２％ (Ｆｅｎｇ ꎬ 和抗脱水力 又不至于使材料受到太多的高渗损 木蓝腋芽分生组织在无菌空气流中脱水 ꎬ ２０１３)ꎮ 伤 谷月等 苹果 Ｍａｌｕｓ ｄｏｍ￣ 含水量为 时 可获得 的成活率 ( ꎬ ２００７)ꎮ “Ｇａｌａ” ( × ４ｈꎬ １６％ ꎬ ５６７％ ｅｓｔｉｃａ 茎尖在 －１蔗糖中预培养 和 苜蓿细胞悬浮培养 Ｂｏｒｋｈ.) ０５ ｍｏｌＬ (Ｎａｉｒ Ｒｅｇｈｕｎａｔｈꎬ ２００９)ꎮ 冻后再生率为 等 啤酒 物在无菌空气流中脱水 含水量为 ７ｄꎬ ７５％ (Ｆｅｎｇ ꎬ ２０１３)ꎮ ４ ｈꎬ ０３３ ｇ 花茎尖在 －１蔗糖中预培养 冻后 －１ 时 两种细胞系 和 的冻后成 ０７５ ｍｏｌＬ ２ ｄꎬ ｇ ＤＷ ꎬ ５ ２６２ ５ ９２９ 成活率约为 等 大叶蝴蝶 活率分别为 和 等 ８０％ (Ｍａｒｔｉｎｅｚ ꎬ １９９９)ꎮ ２５１％ １４３％ (Ｓｈｉｂｌｉ ꎬ ２００１)ꎮ 兰类原球茎在 －１蔗糖中预培养 冻 本实验表明 红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超 ０７５ｍｏｌＬ ３ｄꎬ ꎬ 后成活率和再生率分别为 和 低温保存后的成活率依赖于材料脱水后的含水 ４６６％ ３０％ (Ａｍｉｒ 等 苜蓿细胞悬浮培养物在 －１ 量 与脱水方式无关 只要含水量降至 ꎬ ２０１１)ꎮ ０７５ ｍｏｌＬ ꎬ ꎮ ２１２％~ 蔗糖中预培养 两种细胞系 和 红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超低温 ４ ｄꎬ ５ ２６２ ５ ９２９ ２１３％ꎬ 的冻后成活率分别为 和 等 保存后的成活率均可达到 等 ２２２％ ８１％ (Ｓｈｉｂｌｉ ꎬ ４５％ꎮ Ｗａｎｇ (２０００) 长春花悬浮细胞在 －１蔗糖中预培 在葡萄茎尖的包埋脱水法超低温保存中也发现 ２００１)ꎮ １ｍｏｌＬ ꎬ 养 冻后成活率约为 等 葡萄茎尖在无菌空气流中脱水 含水量为 ７ｄꎬ ５０％ (Ｂａｃｈｉｒｉ ꎬ １９９５)ꎮ ７ ｈ 阿拉伯艾蒿茎尖在 －１蔗糖中预培养 或在干燥硅胶上脱水 含水量为 １０ｍｏｌＬ ３ ｄ １６４％ ４５ｈ １６１％ 后 经无菌空气流脱水 冻后成活率为 时 也均可获得 的成活率 这与 ꎬ ꎬ ４０％ ꎬ ５９３％~６０５％ ꎮ 等 本实验也表明 红芽芋胚性 本实验结果一致 但大叶蝴蝶兰类原球茎在干燥 (Ｓａｒａｂ ꎬ ２０１２)ꎮ ꎬ ꎮ 愈伤组织在 －１蔗糖中预培养 包 硅胶上的脱水效果好于无菌空气流中脱水 干燥 ０７５ ｍｏｌＬ ３ ｄꎬ ꎬ 埋干燥法超低温保存后的成活率为 硅胶脱水 后 含水量为 可获得 的 ４６％~４９％ꎮ ６ｈ ꎬ ３２％ꎬ ３０％ 因此 在包埋干燥法超低温保存中 预培养液中 再生率 等 ꎬ ꎬ (Ａｍｉｒ ꎬ ２０１１)ꎮ 的最适蔗糖浓度一般为 －１ 预培养 化冻方式也会显著影响冻后材料的成活率 ０５~１ ｍｏｌＬ ꎬ ꎮ 时间一般为 具体蔗糖浓度和预培养时间 研究表明 在 的水浴中快速化冻约 ２~７ｄꎬ ꎬ ３７~４０℃ １~ 依植物材料而异 可以避免慢速化冻过程中再次发生结冰 ꎮ ３ｍｉｎꎬ 脱水过程就是将保存材料的含水量降低到一 的冷冻伤害 等 葡萄茎尖包埋脱 (Ｗａｎｇ ꎬ ２０００)ꎮ 个最适范围 包埋珠的含水量是决定细胞成活 水法超低温保存后于 水浴快速化冻 其成活 ꎮ ４０℃ ꎬ 和再生的一个重要因子 等 一般能 率显著高于室温下化冻的效果 等 (Ａｉ ꎬ ２０１２)ꎮ (Ｗａｎｇ ꎬ ２０００)ꎮ 确保植物材料成活的适宜含水量在 本实验结果也表明 太高或太低的化冻温度均不 ２０％~４０％ ꎬ 等 啤酒花茎尖在干燥硅胶上脱 利于红芽芋胚性愈伤组织包埋干燥法超低温保存 (Ａｍｉｒ ꎬ ２０１１)ꎮ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ５１２ ３６ 的冻后成活 只有在 的水浴中化冻 科学 ３３ ꎬ ３７ ℃ ３ ｍｉｎꎬ )ꎬ (１１):２６９—２７２ 红芽芋胚性愈伤组织的冻后成活率可达 ＬｉａｎｇＱＬ(梁乾隆)ꎬ Ｗａｎｇ ＣＢ (王长宝)ꎬ Ｍａ ＸＧ (马祥光) ｅｔ ４７４％ꎮ ａｌ Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ 在进行包埋干燥法超低温保存时 一般不要把包 .ꎬ２０１２.ＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｓｔｕｄｙｏｎＣｈｉｎｅｓｅ Ｌ.(Ａｐｉａｃｅ￣ ꎬ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ 植物科学学报 ３１ 裹的褐藻酸钙去除 可直接将包埋珠进行再培养 ａｅ) [Ｊ]. ( )ꎬ (１): ꎬ １１—２２ 和 本实验表明 是 李火金 (Ｓｅｎ￣Ｒｏｎｇ Ｍｉｎｇ￣Ｈｕａꎬ ２０１３)ꎮ ꎬ ＬｉＨＪ( )ꎬ２０１２. ＲａｐｉｄｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆＹａｎｓａｎｒｅｄ￣ｂｕｄｅｄｔａｒｏ 否去除包裹的褐藻酸钙对红芽芋胚性愈伤组织包 Ｃｈｉ￣ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｖｉｒｕｓ￣ｆｒｅｅｐｌａｎｔｌｅｔｓａｎｄｈｉｇｈｙｉｅｌｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ [Ｊ]. 埋干燥法超低温保存的成活率无显著影响 但可 ｎａＶｅｇｅｔａｂｌｅｓ 中国蔬菜 ( )ꎬ(３):４５—４６ ꎬ 促进其冻后芽长和芽数的增加 本实验结果与 ＭａｒｔｉｎｅｚＤꎬ Ｔａｍéｓ ＲＳꎬ Ｒｅｖｉｌｌａ ＭＡꎬ １９９９. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ꎬ Ｈｕｍｕｌｕｓｌｕｐｕｌｕｓ 等 的实验结果一致 ｖｉｔｒｏ￣ｇｒｏｗｎｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｓｏｆｈｏｐ( Ｌ.) ｕｓｉｎｇｅｎｃａｐ￣ Ｗａｎｇ (２００２) ꎮ ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ １９ ｓｕｌａｔｉｏｎ/ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ (１):５９—６３ 实验结果表明 红芽芋胚性愈伤组织包埋干 : ＮａｉｒＤＳꎬＲｅｇｈｕｎａｔｈＢＲꎬ２００９. Ｃｒｙｏｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ 燥法超低温保存后的平均成活率约为 形 Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａｔｉｎｃｔｏｒｉａ ４５％ꎬ ａｘｉｌｌａｒｙｓｈｏｏｔｍｅｒｉｓｔｅｍｓｏｆ (Ｌ.) ｂｙｅｎｃａｐｓｕ￣ 态学和细胞学检测表明红芽芋胚性愈伤组织冻后 Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ ｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ [Ｊ]. ｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ￣Ｐｌａｎｔ ４５ 再生苗与母本材料相比没有发生变异 ꎬ (５):５６５—５７３ ꎮ ｅｔ ａｌ ＳａｒａｂＡＳꎬＲｉｄａＡＳꎬＭａｈｍｏｕｄ ＡＫ .ꎬ２０１２. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｈｅｒｂａ￣ａｌｂａ ｗｉｌｄＳｈｉｈ ( Ａｓｓｏ.) ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａ￣ 〔参 考 文 献〕 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎａｎｄ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ １０８ ꎬ (３):４３７—４４４ ＡｉＰＦꎬ Ｌｕ ＬＰꎬ Ｓｏｎｇ ＪＪꎬ ２０１２. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ￣ｇｒｏｗｎ Ｓｅｎ￣ＲｏｎｇＨꎬＭｉｎｇ￣ＨｕａＹꎬ２０１３. Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｒａｂｄｏｓｉａｒｕｂｅｓｃｅｎｓ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｃｏ￣ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｓｏｆ ｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎａｎｄ ｆｏｒ ￣ｇｒｏｗｎｓｈｏｏｔｔｉｐｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｇｅｎｕｉｎｅｒｅｄｂｕｄｔａｒｏ( Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｌｏｃａｓｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ ｃｏｒｍｏｓｕｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｒｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ [Ｊ]. ꎬ Ｌ.Ｓｃｈｏｔｔｖａｒ. ｃｖ.Ｈｏｎｇｙａｙｕ) ｂｙｅｎｃａｐ￣ ＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ １０８ ＳｃｉｅｎｔｉａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ １６２ ꎬ (３):３８１—３８７ ｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ :２２６—２３３ ｅｔ ａｌ ｅｔ ａｌ ＡｍｉｒＡＫꎬＵｍａ ＲＳꎬ Ｐａｕｌ Ｌ .ꎬ ２０１１. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏ￣ ＳｈｉｂｌｉＲＡꎬ Ｈａａｇｅｎｓｏｎ ＤＭꎬ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＳＭ .ꎬ ２００１. Ｃｒｙｏｐｒ￣ Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｂｅｌｌｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ ｃｏｒｍ￣ｌｉｋｅ ｂｏｄｉｅｓ (ＰＬＢｓ) ｏｆ (Ｒｃｈｂ. ｆ.) ｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆａｌｆａｌｆａ( Ｌ.) ｃｅｌｌｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓ￣ ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ ２０ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ (５):４４５—４５０ ｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ １０７ 王君晖 边红武 黄纯农 ꎬ (３):４７１—４８１ ＷａｎｇＪＨ( )ꎬ Ｂｉａｎ ＨＷ ( )ꎬ Ｈｕａｎｇ ＣＮ ( )ꎬ ｅｔａｌ ＢａｃｈｉｒｉＹꎬＧａｚｅａｕＣꎬＨａｎｓｚＪ .ꎬ１９９５. Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａ￣ １９９９. Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｍａｔｅｒｉ￣ Ｐｌａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｔｉｏｎｏｆｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌｌｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ａｌｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ [Ｊ]. Ｃｅｌｌ ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ ４３ ｏｆＢｏｔａｎｙ 植物学通报 １６ ꎬ ꎬ (３):２４１—２４８ ( )ꎬ (５):５８２—５８６ ｅｔ ａｌ ＦａｂｒｅＪꎬ Ｄｅｒｅｕｄｄｒｅ Ｊꎬ １９９０. Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ: ａ ｎｅｗ ａｐ￣ ＷａｎｇＱＣꎬ Ｂａｔｕｍａｎ Öꎬ Ｌｉ Ｐꎬ .ꎬ ２００２. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ Ｓｏｌａｎｕｍ ＣｒｙｏＬｅｔ￣ Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ ｐｒｏａｃｈｔｏ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐｓ [Ｊ]. ｖｉｔｒｏ￣ｇｒｏｗｎｓｈｏｏｔｔｉｐｓ ｏｆ ‘Ｔｒｏｙｅｒ’ ｃｉｔｒａｎｇｅ [ ｔｅｒｓ １１ Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ꎬ (６):４１３—４２６ (Ｌ.) Ｒａｆ. × (Ｌ.) Ｏｓｂｅｃｋ.] ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ ｅｔａｌ ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ ２０ ＦｅｎｇＣＨꎬＣｕｉＺＨꎬＬｉＢＱ .ꎬ２０１３.Ｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｓｕｃｒｏｓｅｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ (１０):９０１—９０６ ｅｔａｌ ｉｎｖｉｔｒｏ ｉｓｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ￣ｇｒｏｗｎ ａｐｐｌｅ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐｓ ＷａｎｇＱＣꎬＥｄｎａＴꎬＡｍｉｒＡ .ꎬ２０００.Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆ ￣ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ ｇｒｏｗｎ ｓｈｏｏｔ ｔｉｐｓ ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ １１２ ＰｌａｎｔＣｅｌｌ ＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ ６３ ꎬ (３):３６９—３７８ [Ｊ]. ꎬ ꎬ (１):４１—４６ 谷月 张恩栋 王起华 曾博雅 王智 张云峰 ｅｔａｌ ＧｕＹ( )ꎬＺｈａｎｇＥＤ( )ꎬ Ｗａｎｇ ＱＨ ( )ꎬ２００７. ＺｅｎｇＢＹ( )ꎬＷａｎｇＺ( )ꎬＺｈａｎｇＹＦ( ) .ꎬ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａ￣ ２００９. Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅ( Ｌ.) ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｌｌ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ 植物生理学通 ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｔｉｏｎ [Ｊ]. ( ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓｂｙｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ￣ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ [Ｊ]. 讯 ４３ Ｊｏｕｒｎａｌ 植物生理学通讯 ４５ )ꎬ (６):１１５７—１１６２ ( )ꎬ (６):６０３—６０６ 姜绍通 程元珍 郑志 ｅｔａｌ 郑建平 ＪｉａｎｇＳＴ( )ꎬＣｈｅｎｇＹＺ( )ꎬＺｈｅｎｇＪ( ) .ꎬ ＺｈｅｎｇＪＰ ( )ꎬ２０１０. Ｈｉｇｈｙｉｅｌｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｒｅｄ￣ ＸｉａｎＤａｉＨｏｒｔｉａｕｌｕｒｅ 现代园艺 ２０１２. Ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｒｅｄ￣ｂｕ￣ ｂｕｄｅｄｔａｒｏ [Ｊ]. ( )ꎬ(７):２９— Ｃｏｌｏｃａｓｉａｅｓｕｌｅｎｌａ ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ 食品 ｄｅｄｔａｒｏ( Ｌ.Ｓｃｈｏｔｔ) [Ｊ]. ( ３０
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