Cours Enzymologie Fondamentale et Appliquée

186 Pages·2017·6.16 MB·French

Wageningen Agricultural University
From the SelectedWorks of Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD
Winter February 3, 2016
Cours Enzymologie Fondamentale et Appliquée
(Niveau Master 1)
Mamoudou H. DICKO, Prof.
Available at:https://works.bepress.com/dicko/54/
UNIVERSITE DE OUAGA I
Professeur Joseph Ki-Zerbo
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Unité de Formation et de Recherche en Sciences de la
Vie et de la Terre (UFR-SVT)

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Département de Biochimie-Microbiologie

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Année académique 2015-2016

Laboratoire de Biochimie Alimentaire, Enzymologie,
Deuxième Edition

Biotechnologie Industrielle et Bioinformatique (BAEBIB)

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09 BP. 848 Ouagadougou 09, Burkina Faso ; Fax : [phone],
Tel . + 226 70272643/[phone], Email : [email protected]
URL: http://works.bepress.com/dicko
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ENZYMOLOGIE 1

Crédit 1 : Enzymologie Fondamentale et Appliquée

Code BCH4000

MASTERS DE SCIENCES BIOLOGIQUES

Premier Semestre Parcours SVT :S7 (12 heures)

(Tronc commun)

Notes de cours Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD,
(Professeur Titulaire de Biochimie)

Notes de Cours Prof M. H. DICKO
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Objectifs du cours

L'objectif principal de ce cours est de rappeler et donner aux étudiants les
connaissances indispensables en enzymologie appliquée, à savoir :
- connaître la structure des enzymes, les méthodes d’extraction, de purification,
de dosage et de caractérisation (électrophorèse, zymographie, etc.) des
enzymes ;
- comprendre les principes fondamentaux de la cinétique chimique et la
cinétique enzymatique y compris le rôle des inhibiteurs et autres effecteurs;
- comprendre les méthodes d’immobilisation des enzymes et leurs
conséquences positives ou négatives dans la biocatalyse enzymatique;
- comprendre les différends domaines d’utilisation des enzymes en biochimie
analytique, bio-industries, industrie agro-alimentaires, analyses bio-médicales,
en diagnostic, etc.

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Notes de Cours Prof M. H. DICKO
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SOMMAIRE
CHAPITRE 1.
HISTORIQUE DE L’ENZYMOLOGIE (rappel):…………….…………Page 4

CHAPITRE 2.
BASES DE DONNEES INTERNET SUR LES ENZYMES……….. Page 11

CHAPITRE 3.
DEFINITION, CLASSES, STRUCTURE (rappel) Page 24

CHAPITRE 4.
DOSAGE DES PROTEINES/ENZYMES (rappel)………..……..……Page 49

CHAPITRE 5.
EXTRACTION ET PURIFICATION DES ENZYMES………......……Page 68

CHAPITRE 6.
CINETIQUE ENZYMATIQUE………………………..Page 93

CHAPITRE 7.
IMMOBILISATAION DES ENZYMES…….…..….Page 139

CHAPITRE 8.
INTRO-ENZYMOLOGIE INDUSTRIELLE..……..Page 137

BIBLIOGRAPHIE…………………………………….Page 184

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CHAPITRE 1.

HISTORIQUE DE L’ENZYMOLOGIE

Notes de Cours Prof M. H. DICKO
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I. Historique de l’enzymologie Fondamentale
Les organismes vivants sont le siège d'un grand nombre de réactions biochimiques très
diverses.
Ces réactions s'effectuent dans des conditions où, normalement, elles ne pourraient se faire.
Si elles ont lieu, c'est parce qu'elles sont catalysées par des macromolécules biologiques : les
enzymes.
Le pouvoir de catalyse des enzymes est lié, entre autre, à la très haute spécificité de
reconnaissance des molécules sur lesquelles elles agissent.
L'enzymologie est la partie de la biochimie qui étudie les propriétés structurales et
fonctionnelles des enzymes (la relation structure - fonction).
En particulier, elle s'applique à décrire la vitesse des réactions catalysées par les enzymes.
Il est difficile de situer exactement la découverte de la notion d'enzyme et surtout d'enzyme
en tant que seul catalyseur des réactions chimiques qui se déroulent dans les organismes
vivants.
1783 : Lazzaro Spallanzani a rapporté que la viande est liquéfiée par un extrait gastrique. Il a
noté également que la température a un grand effet.
1814 : Kirchhoff a observé qu'un composant "glutineux" (comme il l'a appelé à l'époque) de
blé convertit l'amidon en sucre.
1833 : La première découverte d'une enzyme est d'habitude attribuée à Anselme Payen et
Jean-François Persozqui ont traité un extrait aqueux de malt à l'éthanol puis précipiter une
substance labile à la chaleur qui hydrolyse l'amidon.
Ils ont appelé cette fraction"diastase" (séparation en Grec) puisque cette fraction sépare le
sucre soluble de l'amidon insoluble. On sait maintenant que cette préparation était une
solution non purifiée d'amylase.
1834 : Theodor Schwann a obtenu le premier un agent actif d'origine animale (la pepsine)
qu'il a partiellement purifiée en traitant la paroi stomacale par l'acide.
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Il est important de souligner qu'à l'époque les premières observations d'activité enzymatique
ont précédé une notion claire et précise de la catalyse. Le concept de catalyse provient de
l'observation de l'action de la diastase et de la pepsine parallèlement à celle de la levure
pendant la fermentation : dans tous les cas, une "substance était changée en une autre "sous
l'influence d'un agent actif : le catalyseur.
A l'époque, la levure n'était pas encore considérée comme une cellule vivante.
1838 : Charles Cagniard de Latour montra que le processus de fermentation est dû à des
organismes vivants.
1858 à 1871 : Les travaux de Louis Pasteur confirmèrent cette idée. Pasteur émit l'hypothèse
révolutionnaire que les changements chimiques lors de la fermentation résultaient des
processus de la vie des micro-organismes impliqués dans la fermentation.
A l'opposé, Liebig et Stahl privilégiaient une théorie purement chimique : un "ferment"était
une substance chimique produite par un organisme en décomposition et les atomes de ce
ferment étaient supposés en mouvement incessant. Cet état d'agitation élevé était transmis
aux atomes de la molécule de sucre (substrat du ferment) dont les éléments devaient être
maintenus par des forces faibles. Il en résultait une scission du sucre en CO et éthanol dont
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les liaisons étaient plus fortes.
1860 : Berthelot fit macérer de la levure et obtint une fraction précipitable à l'alcool capable
de convertir le sucrose en glucose plus fructose. Il conclut que l'invertase (nom qu'il donna à
l'agent actif de cet extrait) était l'un des multiples ferments présents dans la levure.
1876 : Kühne proposa le nom d'enzyme (signifiant "dans la levure") pour qualifier ces
ferments. Le suffixe "ase" fût proposé par Duclaux en 1898.
1897 : Un chimiste allemand, Martin Hahn, tentait d'isoler des protéines de levure
(Saccharomyces cerevisiae) en broyant ces levure dans un mortier avec du sable fin et de
terre de diatomées. Cependant, cette préparation d'extrait de levure se conservait mal.
1897 : La même année, Bertrand observa que certaines enzymes requièrent des facteurs
dialysables pour leur activité : il les nomma coenzymes.
Au début du 20è siècle, de gros travaux furent entrepris pour purifier des enzymes et surtout
décrire leur activité catalytique en termes mathématiques.
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1902 : V. Henri et Adrian Brown suggérèrent indépendamment que la formation d'un
complexe enzyme - substrat est un intermédiaire obligatoire de la réaction enzymatique.
Cette suggestion s'appuyait sur la forme de la courbe obtenue quand on reporte la vitesse
initiale de la réaction en fonction de la concentration en substrat. A. Brown avait étudié la
vitesse d'hydrolyse du sucrose par la β-fructofuranosidase, l'invertase de la levure.
De plus cette suggestion était en accord avec le concept de reconnaissance enzyme - substrat
du type "clé - serrure" proposé par Emil Fisher en 1894.
Henri fût donc le premier à décrire l'équation mathématique reliant l'effet de la concentration
du substrat à la vitesse de catalyse.

1913 : Leonor Michaelis et Maud Menten redécouvrirent l'équation de V. Henri et établirent la
relation connue sous le nom d'équation de Henri - Michaelis - Menten.
Le point important est que l'obtention de cette équation repose sur l'hypothèse qu'il s'établit un
équilibre rapide entre les concentrations de l'enzyme, du substrat et du complexe enzyme -
substrat (E + S <==> ES).
1925 : George Briggs et James Haldane généralisèrent l'équation précédente en introduisant le
concept d'état stationnaire pour la concentration du complexe enzyme - substrat.

Le fait que les enzymes sont des protéines ne fût accepté qu'à partir de la fin des années 20.
De nouvelles techniques chimiques et physiques furent employées pour analyser la structure
des protéines.
1926 : James Summer (Prix Nobel en 1946) cristallisât l'uréase.
Années 30 : John Northrop (Prix Nobel en 1946) et ses collaborateurs cristallisèrent le
pepsinogène, la pepsine et plusieurs isoformes de la trypsine et de la chymotrypsine et
démontrèrent la pureté des cristaux obtenus.
Années 40 et 50 : Des centaines d'enzymes furent purifiées et cristallisées permettant ainsi
l'élucidation de dizaines de voies métaboliques.
1955 : Frédéric Sanger (1er Prix Nobel en 1958) publia la séquence complète en acides aminés
d'une petite protéine : l'insuline (masse molaire 6000 Da).

1957 : La première structure cristallographique d'une protéine (la myoglobine), déduite de la
diffraction des rayons X, fût obtenue par John Kendrew (Prix Nobel en 1962 avec Max
Perutz).
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Années 60: La première séquence d'une enzyme (la ribonucléase, masse molaire 13700 Da)
fût publiée en 1960 et la première synthèse chimique (également de la ribonucléase) fût
obtenue en 1969.
Les biochimistes focalisèrent alors sur le mécanisme de l'activité enzymatique et son mode de
régulation.
1958 : Daniel Koshland a proposé le modèle de l'ajustement induit. Le substrat induit un
changement conformationnel du site actif de l'enzyme.
1961 : Christian Anfinsen (Prix Nobel en 1972) et ses collaborateurs ont montré que, pour un
grand nombre de protéines, c'est la séquence en acides aminés qui détermine le repliement de
la chaîne polypeptidique dans son unique conformation native donc active. Cette conformation
est la plus stable parce qu'elle a une énergie libre minimale.
1963 : Cleland proposa une procédure claire et uniforme pour écrire les équations des
cinétiques des systèmes enzymatiques à plusieurs substrats.

1965 : Jacques Monod (Prix Nobel en 1965), Jeffries Wyman et Jean-Pierre Changeux
proposèrent un modèle cinétique (modèle MWC) pour les enzymes allostériques (enzymes
dont la courbe de vitesse en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïdale et non
une hyperbole).
1966 : Daniel Koshland, Georges Nemethy et Filmer généralisèrent le modèle précédent
(modèle KNF) en incluant la notion d'ajustement induit proposé par Koshland.

1968 , Robert Holley, Har Gobind Khorana, Marshall Nirenberg , Prix Nobel de Médecine ou
physiologie pour leur interprétation du code génétique et de ses fonctions dans la
synthèse protéique.

1978 Werner Arber, Daniel Nathans, Hamilton O. Smith, Prix Nobel de Médecine ou
physiologie pour « la découverte des enzymes de restriction et leur application aux
problèmes de génétique moléculaire ».

Années 80 à nos jours :

1980, Paul Berg¹, Walter Gilbert² et Frederick Sanger, Prix Nobel de Chimie, Pour ses études
fondamentales de la biochimie des acides nucléiques, et en particulier de l'ADN recombinant,
²Pour leurs contributions à la détermination des séquences de bases dans les acides nucléiques.
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1987, Découverte des protéines chaperonnes (Ron Laskey - 1978; John Ellis - 1987) aident au
repliement de certaines protéines ou les maintiennent dans la conformation native quand la
cellule est soumise à certains stress. Ces protéines nativement non-repliées : elles n'ont pas de
structure tridimensionnelle à l'état libre et n'acquière leur structure repliée donc fonctionnelle
que quand elles interagissent avec leurs partenaires cellulaires.
Parmi les chaperonnes, on peut citer :
• les protéines de choc thermique ("Heat Shock Protein - HSP")
• les chaperonines
• les protéines LEA ("Late Abundant Embryogenesis")
1988 , Johann Deisenhofer, Robert Huber et Hartmut Michel, Prix Nobel de Chimie Pour la
détermination de la structure tridimensionnelle d'un site de la réaction photosynthétique

1989 , Sidney Altman et Thomas Robert Cech , Prix Nobel de Chimie Pour la découverte des
propriétés catalytiques de l'acide ribonucléique (Ribozyme)

1992 , Edmond Fischer et Edwin G. Krebs , Prix Nobel de Médecine ou de physiologie
pour « leurs découvertes concernant les phosphorylations réversibles de protéines comme un
mécanisme de régulation biologique ».

1993 , Kary B. Mullis¹, Michael Smith², Prix Nobel de Chimie 1Pour son invention de la
réaction en chaîne impliquant la polymérase et ² Pour ses contributions fondamentales à la
connaissance de la mutagenèse et à l'étude des protéines (enzymes).

1997 Paul D. Boyer¹, John Ernest Walker¹ et Jens Christian Skou², Prix Nobel de Chimie,
¹Pour leur élucidation du mécanisme enzymatique de la synthèse de l'adénosine triphosphate
(ATP), ²Pour la première découverte d'une enzyme transporteuse d'ions, la Na+, K+-ATPase

2001, Leland H. Hartwell et R. Timothy Hunt, Paul M. Nurse, Prix Nobel de Médecine ou de
physiologie pour « leur découverte de la cycline et des enzymes kinases dépendantes de la
cycline, des molécules fondamentales de la régulation du cycle cellulaire ».

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