Conception, synthèse et activité biologique de vecteurs peptidiques pour le ciblage et/ou la ...

324 Pages·2017·11.42 MB·French

by  Fabien Thoreau

THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE LA COMMUNAUTÉ UNIVERSITÉ
GRENOBLE ALPES
Spécialité : Chimie et Sciences du Vivant
Arrêté ministériel : 25 mai 2016

Présentée par
Fabien THOREAU

Thèse dirigée par Didier BOTURYN et
codirigée par Jean-Luc COLL

préparée au sein des laboratoires DCM et IAB
dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

Conception, synthèse et activité
biologique de vecteurs peptidiques
pour le ciblage et/ou la thérapie du
cancer.

Thèse soutenue publiquement le 04 Janvier 2017
devant le jury composé de :
Mme. Céline DOUAT
Chargée de Recherche, Université de Bordeaux, Rapporteur
Mr. Sébastien PAPOT
Professeur, Faculté des Sciences de Poitiers, Rapporteur
Mr. Ahcène BOUMENDJEL
Professeur, Université Grenoble-Alpes, Président
Mr. Frédéric DUCONGE
Chercheur CEA, CEA Orsay, Membre

REMERCIEMENTS

L’heure est venue pour moi de rédiger l’ultime chapitre de cette thèse, elle-même
chapitre d’une vie. Celui des remerciements aux nombreuses personnes sans qui ces trois ans
et demi auraient été impossibles, ou beaucoup moins agréables. Ça risque d’être long, mais
j’aimerais n’oublier personne.

Pour commencer, je remercie l’école doctorale EDCSV qui a financé cette thèse.

Je remercie aussi les personnes qui ont accepté d’examiner ou rapporter cette thèse et qui ont
composé le jury lors de la soutenance :
- Mme. Céline Douat, Chargée de Recherche, Université de Bordeaux.
- Mr. Sébastien Papot, Professeur, Faculté des Sciences de Poitiers.
- Mr. Ahcène Boumendjel, Professeur, Université Grenoble-Alpes.
- Mr. Frédéric Ducongé, Chercheur CEA, CEA Orsay.

Evidemment, je remercie mes deux directeurs de thèse, Didier Boturyn et Jean-Luc Coll, qui
m’ont permis d’obtenir cette thèse.
Plus particulièrement, je remercie Didier pour sa gentillesse, la confiance et l’autonomie qu’il
m’a accordées, tout en restant disponible à chaque instant.
Je remercie Jean-Luc pour sa sympathie, son écoute, et tout ce qu’il a pu m’apprendre.

Je remercie l’ensemble de mes collègues biologistes de l’équipe 5, qui ont toujours bien accueilli
le chimiste que je suis. En particulier, je remercie Maxime, Laetitia, Thibault, Sandrine,
Morgane, Mélanie, Tao, Yoon et Véronique qui ont tous eu à un moment donné la patience et
la gentillesse de m’aider pour des manips, un projet, ou ne serait-ce qu’au détour d’une
conversation.

Je ne peux que remercier mes collègues chimistes (et biologistes pour faire plaisir à Mr.
Benjamin L.) de l’équipe I BM pour leur gentillesse, leur sociabilité et leur disponibilité dont
2
découle une ambiance de travail idéale. Je devrais presque citer tous les permanents de
l’équipe qui m’ont apporté à un moment donné leurs conseils et leur expérience pour un projet,
une candidature de post-doc, les répétitions de soutenance, une tactique de football,
allumer/éteindre la lumière... Merci à tous, pour tout.
Merci aussi à Régine, que j’ai si souvent embêtée pour de l’administratif et qui a toujours
répondu présente et avec le sourire. Merci à l’équipe BEA, nos voisins du dessous, que j’ai pu
côtoyer lors des repas, des matchs de foot, ou de session wii® enflammées.
Je remercie aussi Mélissa, Mickaël et Adrien qui m’ont mis le pied à l’étrier lorsque je suis arrivé
en thèse.
Une personne (mon oncle J-M. T. pour ne pas le citer) a dit :

« Fais de ta passion ton métier, et tu ne travailleras plus jamais ».

Je pense que ce fut le cas pour moi pendant cette thèse, que j’ai adorée. Mais travailler avec
des collègues c’est bien, le faire avec des amis c’est mieux. Et pour ça je ne remercierai jamais
assez mes collègues thésards et post-doc : Adrien (le citadin), Dhruv (l’allégorie de la
gentillesse), Marc (le fu***** Américain), Hugues (le chevelu), Noémie (la best), Fatima (la
lyonnaise !), Laurent (le Lyonnais !, ou Tamalou2), Laureen (Général maman happy), Carlito (le
bel Italien), Benjamin (change rien frer’enh), David (finalement il est gentil), Eugénie (l’artiste,
volcan endormi), Fabien (jeunot dans l’âme), Andrew (so British), Claude (le Glaude), Joao
(POR-TU-GAL !!), Claire (vegan1) et Datchi (vegan2).
Merci pour les discussions, les rigolades et les « franches camaraderies ». Vous allez vraiment
me manquer.

Enfin, il n’y a pas que le boulot dans la vie. Merci donc à tous les amis qui ont jalonné ce
parcours : des historiques « copains de Paul », en passant par « les crazys du baby », les
Nantais, mais aussi tous les amis que nous nous sommes faits sur Grenoble. Merci donc à la
bande des infirmiers.
Plus particulièrement, un magnifique et légendaire merci à Gaëlle, Camille, Loïc et Alex, notre
famille Grenobloise.

Un grand merci à ma famille et ma belle-famille. Un inconditionnel remerciement à mes
parents, qui donnent la force d’avancer car ils ont toujours été là, et le seront toujours. Merci
à mon frère Gaël et ma sœur Delphine, les supporter m’a certainement inculqué la patience,
les côtoyer est dorénavant un plaisir et un besoin.

Pour terminer, merci à Justine, qui a fait de nombreux sacrifices pour me suivre, qui a enduré
mes horaires de travail imposants, qui est un support inconditionnel et sans faille et qui surtout,
rend ma vie plus belle encore.

MERCI

2
ABREVIATIONS .................................................................................................. 7

INTRODUCTION................................................................................................. 9
1. La vectorisation en cancerologie ...................................................................... 13
A. Généralités sur le cancer ........................................................................................................... 13
i. Genèse et développement du cancer .................................................................................. 13
ii. Thérapies du cancer ............................................................................................................. 24
B. Principe général de la vectorisation ....................................................................................... 27
C. Vectorisation passive et microenvironnement tumoral ....................................................... 29
i. L’effet EPR ............................................................................................................................ 29
ii. Les enzymes ........................................................................................................................... 31
D. Vectorisation active : cibles tumorales et motifs de ciblage ................................................ 33
i. Les systèmes de transport ................................................................................................... 33
ii. Récepteurs membranaires .................................................................................................. 40
iii. Récapitulatif des agents de ciblage pour la vectorisation ................................................ 50
2. Outils pour la vectorisation .............................................................................. 51
A. Les différentes formes/structures de vecteur ......................................................................... 51
i. Structures « simples » : Peptides, sucres, ADN, anticorps. .............................................. 51
ii. La Multivalence. ................................................................................................................... 52
iii. Châssis moléculaires ............................................................................................................ 54
iv. Polymères linéaires et dendrimères ................................................................................... 56
v. Nanoparticules ..................................................................................................................... 58
B. Méthode de ligation vecteur – cargo ...................................................................................... 62
i. Liaisons chimiques traditionnelles .................................................................................... 62
ii. Ligations chimiosélectives .................................................................................................. 63
3. Exemples de vectorisation appliquée au traitement/diagnostic du cancer .. 75
A. Vecteurs en Imagerie ................................................................................................................ 75
B. Vecteurs pour la Thérapie........................................................................................................ 77
4. Objectif des travaux de thèse .......................................................................... 80

PARTIE I : Synthèse et activité biologique de vecteurs de double ciblage pour
l’imagerie optique de la périphérie tumorale ................................................... 83
1. Concepts et objectifs du projet ........................................................................ 85
A. Ciblage simultané des récepteurs intégrines αvβ3 et NRP1 .................................................. 86
i. Intégrine αvβ3 et cancer ...................................................................................................... 86
ii. Mieux exploiter l’intégrine αvβ3 grâce au double ciblage .............................................. 93
iii. Le récepteur Neuropiline-1 crosstalk avec l’intégrine αvβ .............................................. 95
3
B. Etat de l’art du ciblage de intégrine αvβ et/ou NRP1 .......................................................... 101
3
C. Conception de vecteurs de double ciblage ........................................................................... 104
2. Synthèses des vecteurs fluorescents ............................................................... 113
3
A. Principe de la synthèse peptidique ........................................................................................ 114
B. Incorporation de building blocks pour des réactions de ligation ........................................ 115
i. Acides aminés modifiés pour la ligation éther d’oxime .................................................. 116
ii. Acides aminés modifiés pour la ligation par cycloaddition de Huisgen ....................... 119
iii. Synthèse d’un châssis moléculaire comportant plusieurs acides aminés modifiés ...... 121
C. Synthèse des vecteurs peptiques ciblant l’intégrine αvβ . ................................................... 125
3
i. Synthèse du châssis composé de quatre oxyamines protégées. ..................................... 125
ii. Synthèse des ligands c[-RXGfK-] avec une fonction aldéhyde. ...................................... 126
iii. Synthèse du châssis RAFT(4-c[RXDfK])NH par ligation oxime ................................... 128
2
iv. Synthèse des molécules RAFT(4-c[RXDfK])Cy ............................................................. 130
5.5
D. Synthèse des vecteurs peptiques ciblant la Neuropiline-1 ................................................... 132
i. Synthèse des ligands Ahx-ATWLPPR et Ahx-LWRPTPA ............................................... 133
ii. Ligands Ahx-ATWLPPR et Ahx-LWRPTPA avec une Cy5.5 ........................................... 134
iii. Synthèse du ligand ATWLPPR présentant une fonction aldéhyde glyoxilique ........... 135
iv. Synthèse du châssis RAFT(4-ATWLLPR)NH par ligation oxime ................................. 137
2
v. Synthèse du composé RAFT(4-ATWLLPR)Cy5.5 ............................................................ 139
E. Synthèse de composés pour le double ciblage simultané des récepteur Intégrine α β et
v 3
Neuropiline-1 ............................................................................................................................ 141
i. Synthèse d’un châssis RAFT(4-acétimidate)-NHBoc-alcyne .......................................... 141
ii. Synthèse d’un châssis RAFT possédant quatre ligands c[RGDfK], une fonction amine
et une fonction alcyne ........................................................................................................ 142
iii. Synthèse d’un châssis RAFT possédant quatre ligands c[RGDfK], une fonction alcyne
et un fluorophore Cy5.5 ...................................................................................................... 144
iv. Synthèse du ligand ATWLPPR avec un linker PEGn-N3. ............................................... 145
v. Synthèse finale des vecteurs RAFT(4-c[RGDfK])-Cy5.5-PEGnATWLPPR .................... 147
vi. Synthèse du châssis RAFT(4-ATWLPPR)-PEG(n)N3 ...................................................... 150
vii. Synthèse finale des RAFT(4-c[RGDfK])-Cy5.5-PEGn-RAFT(4-ATWLPPR) .................. 153
3. Tests biologiques ............................................................................................. 159
A. In vitro ...................................................................................................................................... 159
i. Cytométrie de flux .............................................................................................................. 159
ii. Microscopie Confocale : Etude du marquage de fluorescence ....................................... 172
iii. Western Blot : Etude des voies de signalisation .............................................................. 181
iv. In cell ELISA test. ................................................................................................................ 187
v. Conclusion des tests in vitro .............................................................................................. 192
B. Tests in vivo et ex vivo ..............................................................................................................194
i. Imagerie optique in vivo .....................................................................................................194
ii. Analyses ex vivo après sacrifice des souris ....................................................................... 206
iii. Conclusion des tests in vivo et ex vivo .............................................................................. 213
C. Conclusion des tests biologiques ........................................................................................... 214
4. Conclusion et perspectives du projet de double ciblage ............................... 217

Partie II : Application du scaffold(4-c[RGDfK]) pour des projets de diagnostic
et thérapie du cancer ....................................................................................... 221
1. Exploitation du vecteur RAFT(4-c[RGDfK]) pour des applications
thérapeutiques anticancéreuses. ................................................................... 225
A. Projet RAFT(4-c[RGDfK])porocombo : vectorisation d’un agent proapoptotique .......... 225
i. Objectif du projet ............................................................................................................... 225
4
ii. Synthèses ............................................................................................................................ 227
iii. Activité in vitro et in vivo du RAFT(4-c[RGDfK])Poro2 ................................................. 229
iv. Conclusion .......................................................................................................................... 232
B. Projet RAFT(4-c[RGDfK])-DHP : Vectorisation d’un photosensibilisateur pour la
photothérapie ...........................................................................................................................233
i. Objectifs du projet ..............................................................................................................233
ii. Tests biologiques................................................................................................................ 236
iii. Conclusion .......................................................................................................................... 239
C. Projet RAFT(4-c[RGDfK])-cryptophycine ............................................................................ 240
i. Objectifs du projet ............................................................................................................. 240
ii. Synthèses ............................................................................................................................. 241
2. Exploitation du vecteur RAFT(4-c[RGDfK]) pour des applications
diagnostiques en cancérologie. ...................................................................... 243
A. Synthèse et fonctionnalisation contrôlées de SiNP-RAFT(RGD) fluorescentes .............. 243
i. Principe du projet .............................................................................................................. 243
ii. Synthèses ............................................................................................................................ 245
3. Conclusion de la Partie ii ................................................................................ 247

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ....................................................................249
PARTIE EXPERIMENTALE ............................................................................... 257
i. Matériel et réactifs de synthèse ........................................................................................ 259
ii. Méthodes générales de synthèse ...................................................................................... 260
iii. Protocoles des tests biologiques ....................................................................................... 290
iv. Protocoles de synthèse ....................................................................................................... 261
BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................. 295

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