Charakterisierung aktueller PRRSV Feldisolate in Deutschland

196 Pages·2008·1.49 MB·German

Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Virologie
Außenstelle für Epidemiologie

Charakterisierung aktueller PRRSV Isolate aus verschiedenen
Regionen in Deutschland

INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)

vorgelegt von
Kerstin Fiebig geb. Habekost
(Bad Gandersheim)

Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Irene Greiser Wilke
PD Dr. Elisabeth grosse Beilage

1. Gutachterin : Apl. Prof. Dr. Irene Greiser Wilke

2. Gutachter : Prof. Dr. Georg von Samson-Himmelstjerna

Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2008

Das Promotionsprojekt wurde durch Intervet International BV, Boxmeer, Niederlande
unterstützt
Meiner kleinen und großen Familie in Dankbarkeit!

„Erfahrung vermehrt unsere Weisheit, verringert aber nicht unsere Torheiten“

Josh Billings

Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge

Teile dieser Arbeit wurden vorab veröffentlicht:

FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2006):
Characterization of current Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
field isolates in Germany
In: 7th European Society of Veterinary Virology (ESVV), Lisbon, Portugal, September 24-27,
2006

FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2006):
Aktuelle PRRSV Feldisolate in Deutschland
Intervet-Fortbildungsveranstaltung, Vortrag im Rahmen des Themenkreises: Emerging
Diseases, Schweinfurt, Deutschland, 18. September 2006

FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2006):
Charakterisierung aktueller PRRSV Feldisolate aus verschiedenen Regionen Deutschlands
In: BPT-Kongress, Nürnberg, Deutschland; Vortrag im Rahmen des Themenkreises: Impfen
wir zu viel oder zu wenig?, November 9-12, 2006

FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2007):
Occurrence of NA and EU genotype PRRSV field isolates in a pig dense region of North
Western Germany between 2004 and 2006
In: Emerging and Re-emerging pig diseases, Krakow, Polen, June 24-27, 2007, Poster

FIEBIG, K., GREISER-WILKE, I., GROSSE BEILAGE, E., DREXLER, C. (2007):
Molecular Epidemiology of German and European Porcine reproductive and respiratory
syndrome virus
In: International PRRS Symposium, Chicago, USA, November, 2007, Poster

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG....................................................................................................................1
2. LITERATUR......................................................................................................................3
2.1 PORCINE REPRODUCTIVE UND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS...................................3
2.1.1 Geschichte................................................................................................................3
2.2 CHARAKTERISIERUNG DES PRRSV............................................................................4
2.2.1 Taxonomie und Morphologie...................................................................................4
2.2.2 Genomorganisation von PRRSV..............................................................................5
2.2.3 Virale Proteine..........................................................................................................7
2.3 Genetische und antigene Variabilität.......................................................................9
2.3.1 Replikationszyklus der Arteriviridae.....................................................................10
2.3.2 Immunologie..........................................................................................................11
2.3.3 Impfung..................................................................................................................13
2.3.4 Klinische Symptome..............................................................................................16
2.3.5 Pathologie...............................................................................................................17
2.3.6 Labordiagnostischer Nachweis..............................................................................17
2.3.7 Direkter und indirekter Erregernachweis...............................................................18
2.4 EPIDEMIOLOGIE.........................................................................................................19
2.4.1 Weltweite Verbreitung...........................................................................................19
2.4.2 Erregerübertragung und Virusausscheidung..........................................................21
2.4.3 Persistente Infektion...............................................................................................22
2.5 PHYLOGENETISCHE ANALYSEN ALS HILFSMITTEL DER EPIDEMIOLOGIE..............22
2.5.1 Darstellung phylogenetischer Analysen.................................................................23
2.5.2 Für phylogenetischen Analysen verwendete Algorithmen....................................25
2.5.3 Überprüfung der Robustheit von Bäumen (Bootstrap-Werte)...............................25
2.6 GENETISCHE TYPISIERUNG VON PRRSV.................................................................26
2.6.1 Molekulare Epidemiologie.....................................................................................28
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN....................................................................................31
3.1 MATERIAL..................................................................................................................31
3.1.1 Herkunft des Probenmaterials................................................................................31
3.1.2 Untersuchungsmaterial...........................................................................................32
3.1.3 Virusisolate.............................................................................................................34
3.1.4 Herdenspezifische Daten und statistische Auswertung..........................................34
3.1.5 Zellkultur................................................................................................................35
3.2 METHODEN................................................................................................................37
3.2.1 BLUTENTNAHMETECHNIK...........................................................................................37
3.2.2 KLASSISCHE VIROLOGISCHE METHODEN.................................................................37
3.2.2.1 Passagierung von Marc-145-Zellen.......................................................................37
3.2.2.2 Kultivierung der porzinen Alveolarmakrophagen..................................................38
3.2.2.3 Virustitration..........................................................................................................38
3.2.2.4 Vorbereitung von virushaltigem Organmaterial für die Virusanzucht und den
Virusnachweis........................................................................................................39
3.2.2.5 Virusvermehrung....................................................................................................40
3.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN...................................................................42
3.2.3.1 Isolierung viraler RNA...........................................................................................42
3.2.3.2 Positive und negative Kontrollen...........................................................................44
3.2.3.3 Primer.....................................................................................................................44
3.2.3.4 Reverse Transkription............................................................................................47
3.2.3.5 RT-PCR..................................................................................................................47
3.2.3.6 Reverse Transkriptase Kit......................................................................................48
3.2.3.7 cDNA-Synthese (Protokoll I, SCHEIBNER et al., 2001)......................................48
3.2.3.8 cDNA-Synthese aus dem PRRSV-Genom (Protokoll II, optimiert)......................49
3.2.3.9 Polymerase-Kettenreaktion....................................................................................50
3.2.3.10 Agarosegelelektrophorese....................................................................................52
3.2.3.11 Reinigung der PCR Produkte...............................................................................53
3.2.3.12 Sequenzierung......................................................................................................53
3.2.4 PHYLOGENETISCHE ANALYSE MIT NUKLEOTIDSEQUENZEN........................................54
3.2.5 PHYLOGENETISCHE ANALYSE.....................................................................................55
3.2.6 GRAPHISCHE DARSTELLUNG DER PHYLOGENETISCHEN ANALYSEN............................56
3.2.7 AUSWERTUNG ABGELEITETER AMINOSÄURESEQUENZEN............................................57
3.2.8 ERMITTLUNG VON SEQUENZIDENTITÄTEN UND DER VARIABLEN
NUKLEOTIDPOSITIONEN..............................................................................................57

4 ERGEBNISSE..................................................................................................................59
4.1 OPTIMIERUNG DER RT-PCR...........................................................................................59
4.1.1 Reverse Transkription mit einem spezifischen RT-Primer.......................................59
4.1.2 Reverse Transkription mit Random Primern und einer thermostabilen Reversen
Transkriptase......................................................................................................................60
4.2 KULTIVIERUNG VON PRRSV ISOLATEN IN ZELLKULTUR...........................................61
4.3 ERHEBUNG HERDENSPEZIFISCHER DATEN...............................................................62
4.3.1 Auswertung der herdenspezifischen Daten............................................................63
4.3.2 Einfluss einer akuten PRRSV-Infektion auf die Reproduktionsleistung...............69
4.4 VERGLEICHENDE GENETISCHE TYPISIERUNG DER PRRSV-ISOLATE AUS 35
WIEDERHOLT UNTERSUCHTEN HERDEN IM ORF5.......................................................73
4.4.1 Phylogenetische Analyse der ORF5 Nukleotidsequenzen zwischen 2004 bis 2005.
................................................................................................................................73
4.4.2 Phylogenetische Analyse der ORF5 Nukleotidsequenzen der Isolate aus 2006 bis
2007........................................................................................................................77
4.4.3 Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der GP5-Proteine....................83
4.4.4 Phylogenetische Analyse anhand der ORF7 Sequenzen........................................87
4.4.5 Vergleichende phylogenetische Analyse der abgeleitenen Sequenzen des GP 5 und
N-Proteins...............................................................................................................92
4.5 MOLEKULARE EPIDEMIOLOGIE DEUTSCHER PRRSV-ISOLATE.............................95

5 DISKUSSION.................................................................................................................103
5.1 AMPLIFIKATION DES ORF5 – OPTIMIERUNG DER RT-PCR.................................104
5.2 VERMEHRUNG DER PRRSV-ISOLATE IN ZELLKULTUR.........................................105
5.3 HERDENSPEZIFISCHE DATEN..................................................................................106
5.3.1 Klinik und Impfungen..........................................................................................106
5.3.2 Reproduktionsdaten..............................................................................................108
5.4 MOLEKULARE EPIDEMIOLOGIE AKTUELLER DEUTSCHER ISOLATE.....................109
5.4.1 Genetische Typisierung aktueller PRRSV-Isolate aus 35 Herden
(ORF5-Sequenzen)...............................................................................................110
5.4.2 Genetische Typisierung der PRRSV-Isolate (ORF7-Sequenzen)........................113
5.5 GENETISCHE TYPISIERUNG EUROPÄISCHER ISOLATE...........................................114

6 ZUSAMMENFASSUNG...............................................................................................119
7 LITERATURVERZEICHNIS......................................................................................123
8 ANHANG........................................................................................................................151
8.1 VIRUSISOLATE.........................................................................................................152
8.1.1 Herdenspezifische Virusisolate............................................................................152
8.1.2 PRRSV-Isolate für den Gesamtvergleich.............................................................154
8.1.3 Impfstämme..........................................................................................................159
8.2 KOMMERZIELLE REAGENZIEN UND KITS...............................................................160
8.3 ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN MEDIEN UND REAGENZIEN.................162
8.3.1 Zellkulturmedien..................................................................................................162
8.3.2 Puffer, Zellkultur..................................................................................................163
8.3.3 Sonstige Puffer und Reagenzien..........................................................................164
8.4 GERÄTE UND GEBRAUCHSGEGENSTÄNDE..............................................................165
8.5 VERBRAUCHSMITTEL..............................................................................................166
8.6 SOFTWARE...............................................................................................................168
8.7 GENETISCHER CODE...............................................................................................169
8.8 HERDENSPEZIFISCHE FRAGEBÖGEN.......................................................................171
8.8.1 Fragebogen I.........................................................................................................171
8.9 TABELLEN UND ABBILDUNGEN...............................................................................176
8.9.1 Abbildungen.........................................................................................................176
8.9.2 Tabellen................................................................................................................177