Characterization of the metabolic and transcriptomic response of antibody producing Chinese

291 Pages·2017·30.88 MB·English

Metabolic and transcriptomic response to
hyperosmotic stimulus reveals strategies for
optimization of antibody producing
Chinese hamster ovary cells
VonderFakultätEnergie-,Verfahrens-undBiotechnik
derUniversitätStuttgartzurErlangungderWürdeeinesDoktors
derNaturwissenschaften(Dr.rer.nat.)genehmigteAbhandlung
Vorgelegtvon
JenniferIsabellePfizenmaier-Wu
geb.Pfizenmaier
ausLudwigsburg
Hauptberichter: Prof.Dr.-Ing.RalfTakors
Mitberichter: Prof.Dr.MonilolaOlayioye
TagdermündlichenPrüfung:18.April2017
InstitutfürBioverfahrenstechnik
UniversitätStuttgart
2017

MEINERFAMILIE
Danksagung
Zunächst möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr.-Ing. Ralf Takors danken. Er hat es mir
ermöglichtmeinePromotionaufdemspannendenGebietderZellkulturtechnikzuabsolvieren. Für
seinestetsoffenstehendeTür,diekonstruktivenDiskussionenundnichtzuletztfürseinVertrauenin
meineArbeitundmeineFähigkeitendankeichihmsehr.
Prof.Dr.MonilolaOlayioyedankeichrechtherzlichfürihreBereitschaftdenMitberichtzuübernehmen.
AllentechnischenAngestelltendankeichfürihreUnterstützungunddiestetsguteZusammenarbeit.
HervorhebenmöchteichhierbeiAlexanderDietrich,dermirbeiallentechnischenFragestellungen
währendderKultivierungenstetsmitRatundTatzurSeitestandunddafürsorgte,dasstrotzkurz-
fristigangesetzterAbschaltungenvonGasen,DurckluftoderKühlwasserkeinAbbruchderProzesse
notwendigwar.
Dr. AttilaTelekidankeichfürseinengroßenundausdauerndenEinsatzzurMessungintrazellulärer
MetabolitgehaltemittelsHILIC-ESI-MS/MS.
LisaJunghans,Jens-ChristophMatuszczyk,ElenaBollgönnundMaxBeckerdankeichfürihreHilfe
beidenzahlreichenFiltrationen. IndiesemZusammenhangdankeichinsbesondereLisaJunghans
fürihreBereitschaftmitmirgemeinsamdieNachtzumTagzumachen.
iv
Elena Bollgönn danke ich für die Bearbeitung des Themas "Einfluss von Hyperosmolalität auf
intrazelluläreATP-GehalteantikörperproduzierenderCHO-Zellen"imRahmenihrerBachelorarbeit.
MeinenBürokollegenMaxBecker,LisaJunghans,Jens-ChristophMatuszczykundDr.JérémyRimbon
dankeichfürdietolleundfröhlicheArbeitsatmosphäre,denWissenaustauschunddieVerpflegung
mitNervennahrung.
LisaJunghansdankeichfürdieAnmerkungenzumeinerArbeit.
Annette Michalowski, Eugenia Hoffart, Michael Kraml und Ulrike Hillemann danke ich für die
vielenunvergesslichen,fröhlichenundkulinarischenMittagspausen.
MeingrößterDankgiltmeinerFamilie,insbesonderemeinenElternundmeinemEhemannJingbo.
IhrstehtimmerhintermirundunterstütztmichinallenLebenslagen.
VielenDankfüreuerVerständnis,eurenZuspruchundeureLiebe.
v

Table of Contents
DeclarationofAcademicHonesty xi
Nomenclature xii
ListofFigures xviii
ListofTables xix
Abstract 1
Zusammenfassung 3
1 Introduction 5
2 TheoreticalBackground 9
2.1 ChineseHamsterOvaryCells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 CellCycleandGenome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.3 Mitochondria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.4 Metabolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.5 IndustrialRelevanceofCHOCells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.6 Hyperosmolality . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.7 Transcriptomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.8 ImprovingCellularPerformanceofCHOCellsbyCellLineEngineering . . . . . . . . 51
3 MotivationandObjectives 53
vii
TableofContents
4 MaterialsandMethods 59
4.1 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.1.1 Chemicals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.1.2 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.1.3 BuffersandSolutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.1.4 Consumables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.1.5 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.1.6 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.1 CellLinesandAdaptation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.2 BatchCultivationwithOsmoticShift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.2.3 FastFiltrationApproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.2.4 ExtractionofIntracellularMetabolites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.2.5 AnalyticalMethods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.2.6 DeterminationofSpecificMetabolicRates . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.2.7 Carbon/OxygenBalancingandCalculationofATPFormationRates . . . . . 81
4.2.8 CalculationofAdenineNucleotidePoolSizes . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.2.9 CalculationofErrorsandStatistics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.2.10 miRNAandmRNAExpressionAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
5 Results 89
5.1 PhenotypeofCHODP-12CellsExposedtoHyperosmoticStimulus(+100mOsmolkg-1) 90
5.1.1 G1-phaseArrestandInhibitionofCellGrowthduetoHyperosmolality . . . . 90
5.1.2 MetabolicRatesIncreaseUponOsmoticShift . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.1.3 OsmoticUpshiftReducesTOM22-MediatedMitochondrialFluorescence . . 93
5.1.4 HyperosmoticallyStressedCellsShowEnhancedAvailabilityofATP . . . . . 95
5.1.5 ReliabilityoftheMitochondrialStainingProcedure . . . . . . . . . . . . . 99
5.2 OptimizationofExperimentalSetupforFurtherAnalyses . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.2.1 DeterminationoftheTimeIntervalforAnalyses . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.2.2 PreliminaryTranscriptomeAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5.2.3 IntensificationofHyperosmoticStress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
viii
TableofContents
5.3 MetabolicandTranscriptomicResponseofCHODP-12uponHyperosmoticStimulus
(+150mOsmolkg-1)35hAfterInoculation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
5.3.1 ReducedCellGrowthHampersanIncreaseinc byEnhancedq . . . . . . . 116
P P
5.3.2 ChangesinMetabolicRates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
5.3.3 Enhancedq andIncreasedATP-PoolsRevealaSurplusofEnergy . . . . . 122
ATP
5.3.4 QualityofRNAandNGSRawCounts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
5.3.5 PrincipalComponentandDifferentialGeneExpressionAnalysis . . . . . . . 128
5.3.6 GeneExpressionDynamicsandRelationtoBiologicalFunction . . . . . . . 130
5.3.7 OsmoticUpshiftInducesUpregulationofSevenmiRNAs . . . . . . . . . . . 135
5.3.8 PredictionofPotentialmiRNATargets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
5.4 HyperosmoticPhenotypeofaCellLinewithCHODG44Origin . . . . . . . . . . . . 139
5.4.1 HyperosmolalityEnhancesProductFormationRatesatReducedCellGrowth 139
5.4.2 OsmoticUpshiftIncreasestheNumberofBIBH1CellsinG1-Phase . . . . . . 141
5.4.3 HyperosmoticallyStressedBIBH1CellsShowEnhancedMetabolicActivity . 143
5.4.4 EnhancedATPFormationRatesDoNotResultinElevatedATP-Contents . . . 145
6 Discussion 149
6.1 HyperosmoticPhenotypeofCHODP-12Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
6.1.1 CellGrowthandMetabolism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
6.1.2 MitochondrialCompartmentandCellularEnergeticCapacity . . . . . . . . 152
6.1.3 CellLineSpecificity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
6.2 OptimizationoftheExperimentalSetup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
6.2.1 TimeofAnalysisandIntensifiedHyperosmoticStress . . . . . . . . . . . . 157
6.2.2 TranscriptomeAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
6.3 TranscriptionalResponseofCHODP-12CellsUponHyperosmoticStimulus . . . . . 159
6.3.1 ConservedGeneExpressionChanges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
6.3.2 GeneExpressionDynamicsandRelationtotheHyperosmoticPhenotype . . 161
6.3.3 CorrelationsBetweenDifferentialmiRNAExpressionandtheHyperosmotic
PhenotypeofCHODP-12Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
6.3.4 CellLineEngineeringStrategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
ix
TableofContents
6.4 ConclusionsandFuturePerspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
7 AuthorContribution 171
References 173
A SupportingInformation 203
A.1 FiguresandDataofCultivations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
A.2 TranscriptomicAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
A.2.1 QualityInformationforNextGenerationSequencing . . . . . . . . . . . . 214
A.2.2 RScriptformRNAExpressionAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
A.2.3 RScriptformiRNAExpressionAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
A.2.4 RScriptformaSigProAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218
A.2.5 maSigProClustersforSignificantlyUpregulatedGenes . . . . . . . . . . . . 219
A.2.6 maSigProClustersforSignificantlyDownregulatedGenes . . . . . . . . . . 220
A.2.7 SignificantlyUpregulatedGenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
A.2.8 SignificantlyDownregulatedGenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
A.2.9 CHOspecificGeneExpressionChangesUponHyperosmoticStimulus . . . . 236
B Publications 237
B.1 Manuscript1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
B.2 Manuscript2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
C CompleteListofPublications 271
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