Chapter I Chitosan nanoparticles as carrier systems for the plant growth hormone gibberellic acid

123 Pages·2017·3.96 MB·English

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA

ANDERSON DO ESPIRITO SANTO PEREIRA

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE SISTEMAS
NANOCARREADORES PARA O REGULADOR DE
CRESCIMENTO VEGETAL ÁCIDO GIBERÉLICO

DEVELOPMENT AND EVALUATION OF NANOCARRIES
SYSTEMS FOR THE PLANT GROWTH REGULATOR
GIBBERELLIC ACID

CAMPINAS

(2017)
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE SISTEMAS
NANOCARREADORES PARA O REGULADOR DE CRESCIMENTO
VEGETAL ÁCIDO GIBERÉLICO

DEVELOPMENT AND EVALUATION OF NANOCARRIES SYSTEM
FOR THE PLANT GROWTH REGULATOR GIBBERELLIC ACID

Tese apresentada ao Instituto de Biologia
da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do Título de doutor em Biologia
Funcional e Molecular na área de
Bioquímica.

Thesis Dissertation presented to the
Institute of Biology of the University of
Campinas in partial fulfillment of the
requirements for the degree of doctor in
Functional and Molecular Biology in the
field of Biochemistry.

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA [TESE / DISSERTAÇÃO]
DEFENDIDA PELO ALUNO ANDERSON DO
ESPIRITO SANTO PEREIRA E ORIENTADA PELO
PROFESSOR LEONARDO FERNANDES
FRACETO.

Orientador: LEONARDO FERNANDES FRACETO

CAMPINAS

(2017)

Campinas, 13 de fevereiro de 2017.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto

Prof. Dr. Halley Caixeta de Oliveira.

Profa. Dra. Juliana Lischka Sampaio Mayer

Prof.(a) Dr(a). Gerson de Aráujo Medeiros

Dr. Cláudio Chrysostomo Wernek

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra
no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico minha tese para o Prof. Leonardo Fraceto,
meus pais
e aos meus avos Horácio e Maria José, João e Maria
“No hay absoluto, todo se cambia, todo se mueve, todo revoluciana, todo vuela y se va”
(Frida Khalo)
Agradecimentos

Primeiramente gostaria de agradecer a Deus, por toda força e luz que tem me dado nos
dias bons e difíceis, por ser meu apoio e segurança, meu amigo eterno, e me guiar sempre no
caminho de paz.
Agradecer ao meu orientador Prof. Dr Leonardo Fraceto, pelo apoio durante os
últimos anos, pela formação, suporte e paciência. Foi meu professor durante a graduação, meu
orientador no mestrado e doutorado.Quero agradecer por ser o exemplo de profissional que é,
por ter tido o priviçégio de trabalhar contigo. Sempre levarei teus exemplos comigo.
Agradecer as agências de fomento FAPESP, CONACYT, CNPQ (bolsa de doutorado
e bolsa de doutorado sanduiche, programa Ciências sem Fronteiras) pelo apoio financeiro do
qual foi fundamental para meu crescimento como profissional e realização do projeto.
Agradecer as universidades UNESP e UNICAMP e o centro de pesquisa “CIQA”, por
toda estrutura e apoio dos laboratórios.
Aos meus orientadores mexicanos, Prof. Dr. Jorge Romero e Antônio Ledezma pela
recepção, apoio, conversas e amizade. Obrigado por me receberem de braços abertos e por
estarem com as portas abertas.
Agradeço por todo apoio que tive pelos parceiros de laboratório, pela ajuda, apoio e
por todo tempo passado junto, do qual em especial quero agradecer a Renato Grillo, Nathalie
Ferreira Mello, Cintia Maruyama, Jhones Luis de Oliveira, Estefânia Campos, Paula Mayara,
Carolina Bueno, Cláudia Watanabe, Eric Satori, Daniele Nakasato, Sara Zavala, Gabriela
Padrón, Isela Sandoval e Daniel Caballero.
Agradecer ao grupo de funcionários de todos os institutos que trabalhei, desde aos
responsáveis por limpeza, vigilância, ao grupo técnico, secretários, e todos os docentes que
estiveram presentes na minha formação desde a graduação até o doutorado em especial da
graduação, Renata Lima, Magali Glauzer, Raquel de Mendonça e Silvio Toledo.
Agradecer pelo apoio da minha mãe e meu pai, pela paciência, pelo amor, por estarem
ao meu lado, me ajudarem a crescer, se formar, serem compreensíveis, por serem os grandes
pais e exemplos que são como sinônimos de força, coragem e humildade.
Quero agradecer aos meus afilhados Renan e Lu por serem meus irmãos de espirito
dos quais sempre levo comigo onde eu estiver. Em especial aos meus amigos, Sara Zavala,
Nathalia Zoacal, Paulina Lugo, Kauana Iwassaki, Cintia Maruyama, Luciana Campos, Renato
Grillo, Marcos Paulo Arrivabene, Vitor Aguirre, Cesar Andres, Richie, Paulo Wakida, Edinho
Ribeiro, Pedro Carpigiani, Hernrique Sampaio, Eduardo Geringer e Bruno Vasconcelos.
Agradeço a todos os amigos e familiares, em especial meus padrinhos Hilda e Benedito,
minhas tias Lucia, Maria, Cibele e, Gloria, Cida, Ana, Joana, Terezinha e Geni, e meus tios,
Junior, Francisco, Geraldo, Celso, Roberto, José Horácio, Idevar, Juarez, Arlindo, Nelson,
meus avos, e a todos meus primos (as), a Pat e o Doug, que me fazem rir e sentir bem, por
fazerem parte de minha vida.
A todos, meu muito obrigado!
RESUMO:
A agricultura atual enfrenta problemas para manter seus níveis de produção e qualidade
devido à perda de espaço cultivável, escassez de nutrientes e água como também as mudanças
climáticas. Além destes fatores há a exigência do mercado por produtos com menos resíduos
de agroquímicos e sistemas agrícolas mais sustentáveis. A ciência sempre esteve presente no
desenvolvimento agrícola e nos últimos anos a nanotecnologia vem sendo uma alternativa
para o uso mais eficiente de agroquímicos. Sistemas nanocarreadores podem aumentar a
estabilidade físico-quimica assim como a efetividade em campo de um agrotóxico e ao
mesmo tempo ser menos danoso ao meio ambiente. Neste sentido a literatura tem apresentado
vários sistemas com base nanotecnológica para herbicidas, fungicidas e insecticidas, porém
poucos são os sistemas para reguladores de crescimento vegetal. Reguladores de crescimento
vegetal são moléculas naturais ou sintéticas que desempenham papel fundamental na
agricultura para o desenvolvimento e produção no campo. Entre os diferentes hormônios
vegetais está o ácido giberélico (GA ) o qual desempenha diferentes ações bioquímicas e
3
fisiológicas em diferentes etapas de desenvolvimento no vegetal, porém no campo estes
produtos possuem baixa estabilidade devido a processos de degradação. O presente trabalho
desenvolveu e avaliou diferentes sistemas nanocarreadores de quitosana (CS) para o
carreamento do GA . No capitulo I apresentamos o desenvolvimento de nanopartículas de CS
3
com alginato (ALG) (tamanho de 450±10 nm, PDI (índice de polidispersão) de 0,3, potential
zeta de -29±0,5 mV) e CS/Tripolifosfato (TPP) (tamanho de 195±1 nm, PDI of 0,3, potencial
zeta de +27±3 mV). Neste estudo foram avaliados diferentes sistemas nanocarreadores em
relação ao tamanho, PDI, potencial zeta e os diferentes mecanismos de liberação que
resultaram em diferentes efeitos biológicos na espécie vegetal Phaseolus vulgaris. Ambos os
sistemas apresentaram ótima estabilidade química, avaliados por um período de 60 dias. O
destaque foi para o sistema de ALG/CS-GA que aumentou o desenvolvimento de órgãos
3
vegetais (raízes e parte aérea) e fatores a atividade fotossintética (níveis de clorofilas e
carotenoídes). No capitulo II foi produzido um sistema nanocarreador baseado no polímero γ-
poligluâmico (PGA) com CS (tamanho de 117±9 nm, PDI de 0,43±0,07, e potential zeta de -
29±0,5 mV). Este sistema apresentou ótimas características coloidais e em ensaios biológicos
aumentou o desenvolvimento de raízes laterais. Os três sistemas desenvolvidos possuem
grandes perspectivas para aplicação no campo, de forma a apresentar uma formulação com
base nanotecnologica para o GA que pode resultar em uma alta eficiência no campo. No
3
capitulo III apresenta-se estudos de fitotoxidade em que se avaliou sistemas nanocarreadores
de CS/TPP e lipídicas sólida (SLN) sem carrear ativos químicos, em diferentes espécies
vegetais. Os resultados mostraram que é importante a avaliação destes sistemas isolados de
forma a evitar futuros danos ao meio ambiente. Para as nanopartículas de SLN não houve
efeitos fitotoxicos, porem as nanopartículas de CS/TPP foram capazes de afetar a germinação
e o desenvolvimento vegetal, sendo a concentração um fator determinante para a fitotoxidade
destas partículas. O presente trabalho mostra o potencial de sistemas carreadores de CS para o
GA ,os quais devido as diferentes características possuem diferentes efeitos, o que aumenta
3
suas possibilidades na aplicação agrícola. O presente estudo também mostra o potencial
fitotóxico de que nanopartículas poliméricas sem carrear ativo químico podem causar em
vegetais sendo importante a avaliação destes sistemas antes de futuras aplicações.

Palavras chaves: quitosana, alginato, poliglutâmico, nanopartículas, ácido giberélico.
ABSTRACT:
Agriculture faces problems in maintaining its production and quality levels due to loss of
arable land, nutrient and water scarcity as well as climate change. In addition, there is a
market demand for products with less agrochemical residues and more sustainable agricultural
systems. Science is not present in agricultural development and in recent years
nanotechnology has been an alternative to the efficient use of pesticides. Nanocarrier systems
increase a physical-chemical stability as well as an effectiveness in the field of a pesticide and
at the same time sound less damaging to the environment. This study is based on several
nanotechnology-based components for herbicides, fungicides and insecticides, but they are
the systems for plant growth regulators. Plant growth regulators are natural or synthetic
molecules that play a key role in agriculture for development and production in the field.
Among the different plant hormones is gibberellic acid (GA3) which performs different
biochemical and physiological actions in different stages of development without vegetables,
however, no field these products have low stability due to degradation processes. The present
work developed and evaluated different chitosan (CS) nanocarrier systems for GA3 loading.
In the capital, we present the development of nanoparticles of CS with alginate (ALG) (size
450 ± 10 nm, PDI of 0.3, zeta potential of -29 ± 0.5 mV) and tripolyphosphate (TPP) 1 nm,
PDI of 0.3, zeta potential of + 27 ± 3 mV). This study showed that different nanocrystals
systems are the same as size, PDI, zeta potential and the different release mechanisms resulted
in different biological effects in the plant nature Phaseolus vulgaris. Both systems exhibited
optimum chemical stability, evaluated over a period of 60 days. The prominence of the ALG /
CS-GA3 system has increased the development of plant organs and biochemical factors. A
transport system with no γ-polygluhamic polymer (PGA) with CS (size 117 ± 9 nm, PDI of
0.43 ± 0.07, and zeta potential of -29 ± 0.5 mV) . This system is presented in several columns
and in biological assays increased the development of the apical root, and the number of
lateral roots. The three systems developed have great prospects for field application in order
to present a nanotechnology-based formulation for GA3 that can result in high efficiency in
the field. In Chapter III we present the evaluation studies of CS / TPP and solid lipid carrier
systems (SLN) without carrying out chemical actives in different plant species. The results
show that it is important to evaluate these isolated systems in order to avoid future damages to
the environment. For the nanoparticles of SLN there were no phytotoxic effects, however, the
nanoparticles of CS / TPP were able to affect germination and plant development, being a
determinant factor for the phytotoxicity of the particles. The present work shows the potential
of carrier systems of CS for GA3, which are as different characteristics of use of different
effects, which increases their possibilities in agricultural application. The present study also
shows the phytotoxic potential that polymeric nanoparticles without active chemical active
can cause in vegetables being an important evaluation of systems before future applications.

Keywords: chitosan, alginate, polyglutamic, nanoparticles, gibberrellic acid, .
Sumário
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................... 14
1.1 HORMÔNIOS VEGETAIS .................................................................................................................................... 14
1.2 REGULADORES DE CRESCIMENTO VEGETAL ..................................................................................................... 15
1.2.1 GA ....................................................................................................................................................... 17
3
1.3 NANOENCAPSULAÇÃO: SISTEMAS DE LIBERAÇÃO SUSTENTADA E APLICAÇÕES PARA AGROQUÍMICOS ............. 19
1.4 EFEITOS DE NANOPARTPICULAS EM VEGETAIS. ................................................................................................ 21
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 24
2.1 OBJETIVO GERAL. ............................................................................................................................................... 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. ................................................................................................................................... 24
3 METODOLOGIA GERAL ............................................................................................................................................ 26
3.1 MATERIAIS ........................................................................................................................................................... 26
3.2 METODOS ............................................................................................................................................................. 26
3.2.1 Preparo de nanopartículas ........................................................................................................................ 26
3.2.1.1 Nanopartículas de ALG/CS .................................................................................................................................. 26
3.2.1.2 Nanopartículas de γ-PGA/CS ............................................................................................................................... 26
3.2.1.3 Nanopartículas de CS/TPP ................................................................................................................................... 27
3.2.1.4 Preparo de Nanopartículas Lipídicas Solidas ...................................................................................................... 27
3.2.2 Caracterização das nanopartículas ........................................................................................................... 27
3.2.2.1 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ................................................................................................... 27
3.2.2.2 Tamanho, índice de polidispersão e Potencial Zeta ............................................................................... 27
3.2.2.2.1 Dynamic Light Scattering (Malvern Instruments, UK) ................................................................................ 27
3.2.2.2.2 Dynamic Light Scattering (NanoFlex (Microtec))........................................................................................ 28
3.2.2.2.3 Potencial Zeta .............................................................................................................................................. 28
3.2.2.2.4 Potencial Zeta ............................................................................................................................................... 28
3.2.2.2.5 Estabilidade química dos polímeros (pH) .................................................................................................... 28
3.2.2.2.6 Eficiência de Encapsulação ......................................................................................................................... 28
3.2.2.2.7 Metodologia de quantificação do hormônio GA ......................................................................................... 29
3
3.2.2.2.7.1 Equipamento Varian ProStar................................................................................................................ 29
3.2.2.2.7.2 Equipamento Agilent Technologies 1200 series .................................................................................. 29
3.2.3 Ensaio de cinética de liberação e modelagem matemática........................................................................ 29
3.2.3.1 Ensaio de cinética de liberação ............................................................................................................................ 29
3.2.3.2 Ensaio de cinética de liberação (Alteração de pH e Temperatura)...................................................................... 30
3.2.3.3 Modelo matemático de Korsmeyer - Peppas ........................................................................................................ 30
3.2.4 Microscopias .............................................................................................................................................. 30
3.2.4.1 Preparo das amostras .......................................................................................................................................... 30
3.2.4.2 Microscopia de força atômica (AFM) .................................................................................................................. 31
3.2.4.3 Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM) e Varredura (MEV). .................................................................. 31
3.2.4.5 Analises térmicas. ................................................................................................................................... 31
3.2.4.5.1 Calorimetria Exploratória Diferencial ........................................................................................................ 31
3.2.4.5.2 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)(Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters) .......................... 31
3.2.4.5.3 Analises de Termogravemetria (TGA) )(Discovery DSC, TA Instrumentes/Waters) .................................... 31
3.2.4.6 Fourier transform infrared spectroscopy ............................................................................................................. 32
3.2.5 Atividade Biológica e fitotoxidade ............................................................................................................. 32
3.2.5.1 Atividade biológica das nanopartículas de ALG/CS e CS/TPP-GA ................................................................... 32
3 3
3.2.5.1.1 Determinação do conteúdo de clorofila “a” e “b” e carotenoides.............................................................. 32
3.2.5.2.2 Atividade biológica das nanopartículas de nano-γPGA/CS-GA ....................................................................... 33
3
3.2.5.2.3 Incubação das sementes ............................................................................................................................... 33
3.2.5.2.2 Avaliação do desenvolvimento vegetal ......................................................................................................... 34
3.2.5.2.3 Desenvolvimento vegetal .............................................................................................................................. 34
3.2.5.3 Avaliação da fitotoxicidade das nanopartículas de CS/TPP e SLN ...................................................................... 34
3.2.5.3.1 Ensaio de germinação .................................................................................................................................. 34
3.2.2.2 Avaliação da germinação de sementes ................................................................................................................. 35
3.2.6 Analise dos dados ...................................................................................................................................... 35
CHAPTER I .................................................................................................................................. 36
CHITOSAN NANOPARTICLES AS CARRIER SYSTEMS FOR THE PLANT GROWTH
HORMONE GIBBERELLIC ACID ............................................................................................ 36
ABSTRACT: ................................................................................................................................................................. 37
1. INTRODUCTION ....................................................................................................................................................... 38