Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus (L.) G. (Don) PDF
Preview Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus (L.) G. (Don)
Н.А. Величко, Я.В. Смольникова НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ИНДУЦИРОВАННОГО СИНТЕЗА АЛКАЛОИДОВ В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. (DON) Красноярск 2018 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный университет» Н.А. Величко, Я.В. Смольникова НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ИНДУЦИРОВАННОГО СИНТЕЗА АЛКАЛОИДОВ В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. (DON) Красноярск 2018 1 ББК 36.1 В27 Рецензенты: Г.А. Губаненко, д-р техн. наук, проф. каф. технологии и организации общественного питания ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет» С.Р. Лоскутов, д-р хим. наук, зав. лабораторией физико-химической биологии древесных растений Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН – обособленного подразделения ФИЦ КНЦ СО РАН Величко, Н.А. Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов В27 в клеточной культуре Catharanthus roseus (L.) G. (Don) / Н.А. Величко, Я.В. Смольникова; Краснояр. гос. аграр. ун-т. – Красноярск, 2018. – 230 с. ISBN 978-5-94617-431-2 В монографии изложены научные основы культивирования in vitro ката- рантуса розового (Catharanthus roseus (L.) G. Don), дана технологическая схема получения алкалоидов катарантуса методом культуры ткани. Предназначено для широкого круга специалистов. Особый интерес может представлять для исследователей в области культуры растительных клеток. ББК 36.1 ISBN 978-5-94617-431-2 © Величко Н.А., Смольникова Я.В., 2018 © ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный университет», 2018 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................................... 6 Глава 1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ............................................................................................... 8 1.1. Каллусная ткань в изолированной культуре .................................... 11 1.2. Вторичный метаболизм в растениях in vivo и in vitro ..................... 13 1.3. Условия и способы культивирования растительных клеток и синтез биологически активных веществ .............................................. 17 1.4. Физико-химические факторы среды ................................................. 18 1.4.1. Элиситоры как индукторы вторичного метаболизма в клеточной культуре ткани .................................................................... 34 1.4.2. Механизмы воздействия элиситоров на биосинтетические способности растительной клетки ........................................................ 37 1.4.3. Воздействие элиситоров на регуляцию метаболизма алкалоидов ................................................................................................... 41 1.5. Способы культивирования и их влияние на вторичный синтез в культуре ткани ............................................................................. 51 1.5.1. Культивирование интактных растений ....................................... 52 1.5.2. Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде (суспензионные культуры) ...................................... 52 1.5.3. Культивирование иммобилизованных клеток ............................... 53 Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................ 56 2.1. Объект исследования .......................................................................... 56 2.2. Введение в культуру Catharanthus roseus ........................................ 58 2.2.1. Получение каллусных тканей Catharanthus roseus ....................... 59 2.2.2. Получение суспензионной культуры .............................................. 60 2.3. Иммобилизация тканей Catharanthus roseus на инертный носитель ................................................................................ 61 2.4. Методы оценки физиологического состояния культуры ............... 62 2.5. Элиситоры в качестве биотического воздействующего фактора в культуре ткани Catharanthus roseus ...................................................... 65 2.6. Определение содержания протеина в каллусных тканях Catharanthus roseus .................................................................................... 66 2.7. Определение флавоноидов в каллусной ткани Catharanthus roseus .................................................................................... 67 2.8. Определение сапонинов в каллусной ткани Catharanthus roseus .................................................................................... 67 3 2.9. Количественное определение содержания свободных аминокислот ............................................................................ 68 2.10. Определение суммарного содержания алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus .................................................... 69 2.11. Разделение алкалоидов Catharanthus roseus методом высокоэффективной жидкостной хроматографией ................................ 70 2.12. Определение хлорофилла ................................................................. 71 2.13. Определение ферментативной активности ферментов шикиматного пути ХДГ и ШДГ ............................................................... 71 2.14. Определение химического состава плодового тела гриба Pleurotus оstreatus ....................................................................................... 72 2.15. Методы исследования хвойных водных экстрактов ..................... 74 2.16. Культивирование дереворазрушающего высшего гриба Pleurotus ostreatus (Fr. Kumm) на послеэкстракционном остатке каллусной ткани Catharanthus roseus .......................................................................... 76 Глава 3. ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ CATHARANTHUS ROSEUS .......... 78 3.1. Получение интактных стерильных растений Catharanthus roseus в культуре in vitro ................................................... 78 3.2. Получение каллусной ткани и суспензионной культуры Catharanthus roseus .................................................................................... 84 3.2.1. Влияние уровня освещенности на процессы роста и развития каллусной ткани Catharanthus roseus....................................................... 92 3.2.2. Влияние различных концентраций сахарозы на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus .................................. 94 3.2.3. Влияние инозита и гидролизата казеина на рост ткани и накопление алкалоидов............................................................................ 98 3.2.4. Влияние гормонального состава среды на рост и развитие каллусов Catharanthus roseus ................................................................... 102 3.2.5. Влияние модуляторов вторичного метаболизма на активность ключевых ферментов шикиматного пути .................. 113 3.2.6. Влияние минерального состава среды на рост и структуру каллусной ткани Catharanthus roseus .............................. 115 3.2.7. Влияние фосфатного компонента на рост каллусной ткани Catharanthus roseus и накопление алкалоидов ....................................... 131 Глава 4. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ CATHARANTHUS ROSEUS ........................................................................ 136 4.1. Суспензионная культура Catharanthus roseus ................................ 136 4.2. Иммобилизация каллусной ткани Catharanthus roseus на пенополиуретановые пластины ......................................................... 145 4 4.3. Влияние способа культивирования на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus ..................................................... 147 Глава 5. ВЛИЯНИЕ ЭЛИСИТОРОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ НА БИОСИНТЕТИЧЕСКУЮ СПОСОБНОСТЬ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ CATHARANTHUS ROSEUS .................................................. 152 5.1. Динамика роста и накопление индольных димерных алкалоидов в культуре Catharanthus roseus под действием элиситоров мицелиальных, дрожжевых грибов и хвойных экстрактов ................................................................................................. 152 5.2. Качественный и количественный состав свободных аминокислот в каллусной ткани Catharanthus roseus .......................... 163 5.3. Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани Catharantus roseus после элиситации .......................................... 165 5.4. Активность ферментов шикиматного пути .................................... 169 5.5. Химический состав плодового тела Pleurotus ostreatus ................ 170 5.6. Состав хвойных водных экстрактов сосны .................................... 176 Глава 6. ПРОБЛЕМА РЕГУЛЯЦИИ И СТРАТЕГИИ КОНТРОЛЯ ПРОЦЕССОВ ВТОРИЧНОГО СИНТЕЗА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ..................................................................................................... 180 Глава 7. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ................................................................ 193 7.1. Технологический процесс получения каллусной ткани и алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus ........................ 194 7.2. Оптимизация процесса извлечения алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus ................................................ 197 7.3. Химический состав каллусной ткани Catharanthus roseus после культивирования дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus (Fr. Kumm) ................................................................ 200 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................ 203 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .................................. 205 ПРИЛОЖЕНИЯ ........................................................................................ 228 5 ВВЕДЕНИЕ Растительная клетка – уникальный источник ценных биологиче- ски активных веществ разной химической природы, которые обладают не только широким спектром лечебного действия, но и применяются в парфюмерии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Хими- ческие аналоги данных веществ, как правило, содержат сопутствую- щие примеси, проявляющие негативное действие на организм челове- ка и животных. Кроме того, многие специфические биологически ак- тивные вещества, такие, как алкалоиды, являются продуктами отда- ленного синтеза у растений и их искусственное получение затруднено в связи с многостадийностью процесса, низким выходом основного продукта и его дороговизной [1, 2]. Поиск альтернативных источников и разработка методов получе- ния биологически активных веществ растительного происхождения, сопоставимых или превосходящих по эффективности, использование традиционного сырья определяют актуальность этой проблемы. Одним из таких методов является культура клеток и тканей растений in vitro. Культивируемые клетки высших растений способны синтези- ровать традиционно используемые продукты растительного происхож- дения, создавать принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществом данного метода является круглогодичное получение продукта независимо от внешних климатических и почвенных условий, а также сохранение естественных ареалов ценных лекарственных растений [3, 4, 5]. Основной проблемой метода культуры тканей и клеток высших растений в аспекте получения ценных вторичных метаболитов являет- ся низкий конечный выход продукта. Это обусловлено тем, что в ус- ловиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, при- сущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной, чем в целом организме, «сверхзадачей». Актуальным при использовании культур тканей и клеток высших растений с целью получения ценных вторичных веществ является поиск условий, при которых обеспечивались бы оптимальный рост и оптимальное содер- жание вторичных веществ в биомассе. Основными факторами, регу- лирующими эти процессы в культуре in vitro, являются искусственные регуляторы роста и способы культивирования тканей и клеток. Роль искусственных регуляторов роста в процессах деления кле- ток in vitro изучена достаточно глубоко. Однако существенное влия- 6 ние на выбор вида регулятора, его концентрацию оказывают видовая принадлежность, генотип, а также эпигенетические факторы [6]. По- этому подход к каждой конкретной культуре остается эмпирическим. Данные по влиянию регуляторов роста на процессы вторичного синте- за в разных культурах весьма противоречивы. Этот вопрос требует дальнейшего серьезного изучения [7]. Применение того или иного способа культивирования сущест- венным образом определяет как скорость роста биомассы, так и ин- тенсивность биосинтетических процессов. Традиционные методы культивирования (поверхностное и глубинное) имеют ряд существен- ных недостатков. Иммобилизация клеток на инертный носитель явля- ется перспективным подходом для биотехнологического использова- ния культур высших растений. Преимуществом создаваемых клеточ- ных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) является следующее: 1) получение продукта независимо от внешних климати- ческих, почвенных условий и возможность культивирования клеток тропических растений; 2) оптимизация и стандартизация условий вы- ращивания; 3) перспективы полной автоматизации и компьютериза- ции процессов. Культивирование тканей и клеток высших растений in vitro (в частности, Catharanthus roseus (L.) G. Don) с целью их промыш- ленного использования для получения соединений специализирован- ного обмена определяет актуальность данного исследования. 7 Глава 1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В связи с возрастающими требованиями к рациональному ис- пользованию сырья, напряженной экологической обстановкой воз- росло внимание исследователей и производственников к вопросам создания рациональных и технически обоснованных безотходных технологий получения и переработки ценных продуктов вторичного синтеза растений. Традиционно биологически активные вещества растений полу- чали на основе использования природного сырья. Из сотен тысяч ле- карственных средств, применяемых в мировой медицинской практи- ке, лечебные препараты из растений составляют свыше 30 %, в нашей стране на их долю приходится около 40 %. Препараты из растений по сравнению с синтетическими лекарствами имеют ряд преимуществ. Будучи сложными по составу, они содержат много ин- гредиентов, которые придают им ценные свойства и обеспечивают многостороннее действие на организм. Кроме того, препараты расти- тельного происхождения, обладающие стойким терапевтическим эф- фектом, как правило, малотоксичны и редко оказывают побочное действие [8]. Часть лекарственных растений получают с полей спе- циализированных хозяйств, где их культивируют и собирают меха- ническим способом. Однако до сих пор 50 % всей массы заготавли- ваемого сырья получают от сбора дикорастущих растений, хотя при- меняются меры к расширению площадей и повышению урожайности культивируемых лекарственных растений. Для многих растений по- левая культура пока не удается [9]. Широкое применение растений, как источника для получения ценных биологических веществ, приводит к стремительному сокра- щению их природных популяций. Нередко в этом списке оказывают- ся лекарственные растения эндемичных и редких видов [10]. По оценке экспертов, на территории России произрастают около 3000 видов растений, обладающих полезными свойствами. На долю редких и исчезающих приходится около 4 % [11]. В настоящее время наблюдается лавинообразное (сотни видов ежегодно) исчезновение видов в результате антропогенного воздействия [8]. В качестве про- мышленного сырья в основном используются корневища, в результа- 8 те чего всѐ растение погибает, а заросли эндемичных и редких видов растений, как правило, восстанавливаются крайне медленно. Поэтому возникла необходимость поиска альтернативных источников получе- ния различных биологически активных веществ [12]. В настоящее время достаточно широко разрабатываются методы, обещающие зна- чительный прогресс в решении вопросов рационального использова- ния природных ресурсов. Один из них – культура клеток и тканей in vitro [13]. Культура клеток и тканей растений в биотехнологии яв- ляется не только альтернативным источником необходимых биологи- чески активных веществ, но и нетрадиционным методом охраны ле- карственных растений [14]. В отличие от микроорганизмов, которые издавна используются в традиционных технологиях (хлебопечение, производство кисломолочных продуктов и др.), культуры клеток высших организмов являются сравнительно новым объектом биотех- нологии. На их жизнедеятельности может быть основано производ- ство биологически активных веществ, вакцин, моноклональных антител [15]. Эксперты признают, что биотехнология является единст- венной наукой, которая может привести к гарантированному получе- нию сельскохозяйственных продуктов и биологически активных ве- ществ с заданными свойствами [16, 17]. В основе метода культуры клеток и тканей высших растений лежит принцип тотипотентности растительной клетки, то есть спо- собности реализовывать свой генетический потенциал в зависимости от регуляторных эпигенетических факторов (или условий выращива- ния) [18]. Изменение условий выращивания (состав питательной сре- ды, температура, освещенность и т. д.) позволяет либо поддерживать неорганизованное размножение в длительной пересадочной культуре, либо индуцировать морфогенез [19]. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях, а также онтогенеза, генетики, расти- тельной вирусологии и других. Простота клеточных моделей, воз- можность быстро получать достаточную биологическую массу в асептических, контролируемых по многим параметрам, условиях вы- ращивания являются преимуществами такого моделирования [20]. Практическое значение культуры ткани заключается в возможности выращивания больших количеств биомассы (например, женьшеня, элеутерококка, и т. д.) с целью получения из нее ценных веществ. Применением клеточной инженерии в культуре ткани растений 9
The list of books you might like
