Caractérisation des activités de biodégradation des hydrocarbures par différents genre microbiens

129 Pages·2015·23.66 MB·French

Mémoire
En vue de l’obtention du Diplôme de
Magister en Biologie

Option :
Biologie moléculaire et Génétique des microorganismes

Par : Mlle BEKENNICHE NAHLA

THEME :

Caractérisation des activités de biodégradation des hydrocarbures
par différents genre microbiens isolés de sites contaminés

Soutenue le 09 Mars 2014
Devant les membres de jury:
Pr. AOUES Abdelkader : Président, Université Es-Sénia Oran

Pr. BEKKI Abdelkader: Examinateur, Université Es-Sénia Oran

Pr. BELAHCENE Miloud: Examinateur, Centre universitaire Ain-Témouchent

Pr. BENSALAH Farid : Encadreur, Université Es-Sénia Oran

Année Universitaire : 2013/2014
Remerciements

J’adresse mes remerciements à Monsieur Belehcène et
Monsieur Beki pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Je tiens également à remercier Monsieur Aous pour
l’intérêt qu’il a porté à ce travail en acceptant de le juger aisi que Pr. Bensalah
qui m’a encadrer

Je témoigne également ma reconnaissance à mes parents, mon frère, mes sœur
et mes amis qui ont été toujours présents pour moi et qui m’ont soutenu tout au
long de ces années.

Pour finir, il me serait difficile d’omettre de remercier tous ceux qui ont
contribué de
prés ou de loin à ce travail. Qu’ils trouvent dans ses quelques lignes
l’expression de mes
sincères remerciements.
Dédicaces

A ma chère maman qui n’a jamais cessé de ménager ses efforts pour
que j’atteigne ce niveau.

A mon cher papa qui a su se montrer patient, compréhensif et
Encourageant

A mon frère Yacine, à mes sœurs Wiem et Loubna qui étaient toujours
à mes
côtés et qui n’ont jamais cessé de me soutenir et de m’encourager,

Jamais de simples mots ne me permettront d’exprimer mes plus vifs
Remerciements à Mr.Ait Abdeslam qui m’a toujours soutenu sans la
moindre hésitation, qui m’a aider à réaliser ce manuscrit et qui s’est
montré plus que serviable.
Merci Nacer …
Résumé

Ce travail s’est basé sur l’élaboration d’une collection de souches isolées à partir de différents
sites pollués par les hydrocarbures pétroliers et rejets industriels, et l’implication de ces
souches dans la biodégradation des hydrocarbures (pétrole, phénol, rejet industriel,…)
L’objet de notre étude est la biodégradation des hydrocarbures, plus précisément le phénol, le
pétrole brut et le rejet industriel ainsi que la détection des polluants dans les eaux et les sols
recueillis dans la région d’Oran : raffinerie d’Arzew, port d’Arzew et d’Oran ainsi que la zone
de Betioua et la région de Rouddnouss à Hassi Messaoud. On a aussi étudié la caractérisation
des bactéries qui dégradent les hydrocarbures et leur identification moléculaire par méthode
PCR.
On a pu isoler des souches à caractères variés qu’on a testés par une méthode de coloration en
effectuant le test INT qui s’est avéré positif pour plus de 50% des souches. On a étudié le
potentiel de dégradation de ces isolats par une méthode de pulvérisation de pétrole sur boites
gélosées. On a isolé des souches qui tolèrent le phénol à des concentrations variant de 0.5 à
1.5 g/l. Parmi la collection, des souches ont été identifiées par PCR par des amorces
universelles ADNr 16s, ces isolats ont été apparentés au genre Pseudomonas sp.
On a recherché le gène de dégradation alk B qui code pour l’alkane hydroxylase par méthode
PCR avec des amorces spécifiques.

Mots clefs : biodégradation, phénol, Hydrocarbures, Pseudomonas, pétrole brut.
summary

This work is based on developing a collection of isolated from sites contaminated by petroleum
hydrocarbons and industrial discharges strains and the involvement of these strains in the
biodegradation of hydrocarbons (oil , phenol , industrial waste , ... )
The purpose of our study is the biodegradation of hydrocarbons , specifically phenol, crude oil and
industrial as well as the detection of pollutants in water and soil collected in the region of Oran
rejection: Arzew refinery port Arzew and Oran and Betioua area and region Rouddnouss in Hassi
Messaoud . We also studied the characterization of bacteria that degrade hydrocarbons and
molecular identification by PCR.
It was possible to isolate strains that have different characters tested by a method of performing the
INT staining test was positive for more than 50 % of the strains . We studied the degradation
potential of these isolates by a method of spraying oil on agar dishes . Was isolated strains tolerant
phenol concentrations ranging from 0.5 to 1.5 g / l. Amongst the collection of strains were identified
by PCR with universal primers 16s rDNA , these isolates were related to the genus Pseudomonas sp .
We searched degradation gene encoding B alk alkane hydroxylase by the PCR method with specific
primers .

Keywords: biodegradation , phenol , hydrocarbons , Pseudomonas, crude oil.
Liste des figures

Figure 1: Principales contributions annuelles pour la pollution pétrolière mondiale entre 1990 et 1999
(en pourcentages), adapté du rapport du National Research Council (NRC) de 2003 ........................ 08
Figure2 : la pollution des plages par les marées noires (des plages bretonnes du Finistère et
des Côtes d’Armor, entre Morlaix et Perros-Guirrec) ............................................................ 09
Figure3 : les effets des marées noires sur les oiseaux (Marée noire dans le Golfe du Mexique)
.................................................................................................................................................. 09
Figure4 : Processus physico-chimiques et biologiques intervenant dans l’évolution d’une
nappe de pétrole en milieu marin ........................................................................................... 13
Figure5 : Principe de la biodégradation aérobie des hydrocarbures ...................................... 15
Figure6: Processus abiotiques et biotiques conduisant à l’élimination naturelle du pétrole en milieu
marin ......................................................................................................................................... 18
Figure7: Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures par les microorganismes .... 20
Figure8 : Mécanisme de l’oxydation d’un n-alcane en alcool primaire par le système
cytochrome P450 ..................................................................................................................... 22
Figure 9 : Mécanisme de l’oxydation d’un n-alcane en alcool primaire par le système
Rubredoxin ............................................................................................................................... 22
Figue10.a : formation d'un alcool à partir du n-alkyl-hydroperoxyde puis oxydé en aldéhyde
.................................................................................................................................................. 22
Figure 10.b : Oxydation terminale via la formation d’alcène par une souche de Pseudomonas
aeruginosa ............................................................................................................................... 23
Figure 11 : voie métabolique de l’oxydation subterminale .................................................... 24
Figure12 : Voie métabolique via l’oxydation terminale et subterminale des acides ............. 25
Figure 13 : Voies métaboliques de la dégradation des hydrocarbures ramifiés par
Pseudomonas citronellolis suivant la voie "Citronellol" ........................................................ 26

Figure 14 : Mécanisme de dégradation du pristane. .............................................................. 27
Figure 15: Voie métabolique de la dégradation du squalane par Mycobacterium fortuitum et
Ratisbonense 28
Figure16 : voies métaboliques de la dégradation des alcènes terminaux .............................. 29
Figure17: Biodégradation des cycloalcanes non-substitués ................................................... 30
Figure 18 : Voies métaboliques de la dégradation des alkyl-cyclohexanes ........................... 31

Figure 19. Assimilation de l’acide cyclohexyl-carboxylique par Alcaligenes sp. PHY 34
suivant un mécanisme de β-oxydation .................................................................................... 35
Figure 20 : La voie métabolique de dégradation du Naphtalène par Pseudomonas sp et
Acinetobacter calcoaceticus .................................................................................................... 36
Figure 21 : La voie aérobie de dégradation bactérienne de l’anthracène par Pseudomonas
Aeruginosa .............................................................................................................................. 37
Figure 22 : Métabolisme du phénanthrène par différentes espèces de champignons ............ 43

Figure 23 : Activation de la réaction de dégradation anaérobie du naphtalène par l’addition
de CO2 ..................................................................................................................................... 43
Figure24: Meta-pathway de dégradation du phénol. ............................................................ 48
Figure25:Ortho-pathway de dégradtion du phénol ............................................................... 49
Figure26 : Localisation des régions de prélèvement des échantillons ............................................. 51
Figure 26.a : lieu de prélèvement du sol calcique et fertile ................................................... 52
Figure27 : schéma du test INT .................................................................................................... 47
Figure28 : Méthode de dilutions décimales ........................................................................... 51
Figure29: Schéma du protocole de dégradation du pétrole sur milieu solide ........................ 53
Figure30 : shéma de dégradation du phénol .......................................................................... 58
Figure31 : photos de l’appareil d’électrophorèse utilisé ................................................................ 60

figure32: Pourcentage des différentes souches isolées des échantillons récoletés de zones
pollées par les hydrocarbures .................................................................................................. 67
Figure33 : aspect macroscopique de quelques souches à l’état natif ................................... 70
Figure34: Résultat du test INT pour les échantillons récoltés ............................................... 70
Figure 35 : Résultat du test INT des sols pris à une profondeur de 3 mètres ....................... 71
Figure 36: Résultat du test INT des échantillons d’eau ......................................................... 72
Figure 37 : Aspect microscopique et macroscopique d’une souche (LGM52) suspectée être
du genre Pseudomonas ........................................................................................................... 81
Figure38: souches apparentées au genre Pseudomonas et la pigmentation verte sur cétrimide
.................................................................................................................................................. 82
Figue39 : Résultat du test INT sur quelques souches isolées ................................................. 83
Figure 40: Schéma récapitulatif du protocole de la méthode de spray .................................. 84
Figure41: Exemple de quelques interactions de souches avec le pétrole sur milieu MSM agar
.................................................................................................................................................. 86
Figure42: Interactions des souches qui ont réagit avec le pétrole dans le milieu liquide ...... 87
Schéma43 : Schéma récapitulatif du protocole de la méthode de dégradation du phénol ..... 88
Figure44 : souches apparentées au genre Pseudomonas et la pigmentation verte sur cétrimide
.................................................................................................................................................. 90
Figure45 : Amplification PCR du gène Alk B pour la détection du genre Pseudomonas par
les amorces Alk B ................................................................................................................... 92
Figure46 : Amplification du gène ADNr 16s pour la détection des Pseudomonas par les
amorces universelles ADNr 16s .............................................................................................. 94
Liste des tableaux

Tableau 1: Exemple de bactéries impliquées dans la biodégradation des hydrocarbures ..... 17
Tableau 2 : Principales souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation des
HAPs. ..................................................................................................................................... 33
Tableau 3: Principe des étapes de la coloration de Gram ...................................................... 56
Tableau 4: Les différents caractères des souches isolées ....................................................... 72
Tableau 5: Les différents caractères des souches apparentées au genre Pseudomonas ......... 81
Tableau 6: La poussé des échantillons sur MSM à des concentrations variables de phénol 89
Tableau 7 : Caractères macroscopiques et microscopiques des souches qui tolèrent le phénol
.................................................................................................................................................. 90
Liste des abréviations
BET : Bromure d’Ethidium
 Unités de mesures
BLAST: Basic Local Alignment Search
°C : Degré Celsius
Tool
cm, mm, nm : Centimètre, millimètre,
ddNTP : didésoxycléoside triphosphate
D : Diamètre
dNTP : désoxycléoside triphosphate
g, mg : Gramme, milligramme
EDTA: Ethylene diamine Tetra-acetic acid
h, min, s : heure, minute, seconde
G+C: Guanine + Cytosine
l, ml, µl : Litre, millilitre, microlitre
GC : chromatographie gazeuse
M, mM : Molaire, millimolaire
GN: Gélose nutritive
nanomètre
Hcl: Acide chlorhydrique
rpm : Rotation par minute
HPLC : High pression liquid
U : Unité
chromatographie
UI : Unité Internationale
LB : liquid brouth
V/V : Volume par volume
MgCl; chloride de Magnésium

MSM: mineral salt medium
 Autres abréviations
pb : paire de bases.

PCR: polymerase chain reaction
ADH : Arginine Dihydrolase
pH: Potentiel d’Hydrogène
ADN : Acide Désoxyribonucléique
QSP: Quantité suffisante pour
ARNr : Acide Ribonucléique
sp. : Espèce non précisée
Ribosomique
TAE : Tris Acétate EDTA
ATCC: American Type Culture
Taq : Thermophillus aquaticus
Collection
UFC : Unité Formant Colonie
ATP: Adénosine triphosphate
UV : Ultra Violet
HAPs Hydrocarbures Aromatiques
INT : le chlorure de 2-(p-iodophényl)-
Polycycliques
3(p-nitrophényl)- 5-phényI tétrazolium
Table des matières
Introduction 1
Partie I : Rappel bibliographique
Chapitre 1 : les hydrocarbures 4
I. Les hydrocarbures 4
I.1. Généralités sur les hydrocarbures 4
I. 2. Origine des hydrocarbures 4
I. 3. Nature des différents types d’hydrocarbures 5
I. 3. 1. Composés pétroliers 5
I.3.1.1. Hydrocarbures saturés 5
I.3.1.2. Hydrocarbures aromatiques 5
I.3.1.3. Composés polaires 5
I.3.1.4. Asphaltènes 6
I.3.2. Hydrocarbures biogènes 6
I.3.2.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturés 6
I.3.2.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturés 7
I.3.2.3. Les cycloalcanes et les cycloalcènes 7
I.3.2.4. Les hydrocarbures aromatiques 7
I.4. Pollution de l’environnement par les hydrocarbures 7
I.5. Impact des hydrocarbures sur l’environnement 8
I.6. Devenir des hydrocarbures dans le sol (cas des hydrocarbures aliphatiques 10
polycycliques « HAP ») :
I.6.1. Le sol : système polyphasique : 10
I.6.2. Définition de la matière organique 10
I.6.3. Mobilité et transport des HAP dans les sols 10
I.6.4. Méthodes de remédiassions des sols pollués par les hydrocarbures 11
I.6.4.1. Traitement par remplacement 11