Caractérisation de 2 transporteurs ABC (“ATP-Binding Cassette”) bactériens de fonction inconnue

231 Pages·2017·20.09 MB·French

by  Carmen Galian Barrueco

UNIVERSITE JOSEPH FOURIER - GRENOBLE I

ECOLE DOCTORALE CHIMIE ET SCIENCES DU VIVANT

Doctorat en
Biologie Structurale et Nanobiologie

Carmen GALIÁN BARRUECO

Caractérisation de 2 transporteurs ABC
(“ATP-Binding Cassette”) bactériens de fonction inconnue :
YheI/YheH de Bacillus subtilis et Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis

Thèse dirigée par le Dr. Jean-Michel JAULT

Soutenue le 19 décembre 2008 à Grenoble

Composition du Jury
Dr. Daniel BRETHES Rapporteur
Dr. Elie DASSA Rapporteur
Prof. Eva PEBAY-PEYROULA Examinateur
Dr. Daniel LEVY Examinateur
Dr. Jean-Michel JAULT Directeur de thèse

Thèse réalisée à l’Institut de Biologie Structurale J.-P. Ebel (UMR 5075 UJF/CNRS/CEA) et au
Laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire (ancienne UMR 5090 UJF/CNRS/CEA)

MERCI

à Jean-Michel, de son excellent encadrement, son enthousiasme scientifique, sa capacité à
interpréter positivement les résultats, sa disponibilité illimitée, ses grandes
qualités humaines, sa bonne humeur, ses encouragements quotidiens

à Daniel et à Elie, d’avoir accepté de juger ce travail de thèse
à Eva, de bien vouloir présider le jury et examiner ce travail
à Daniel, d’intégrer le jury et d’examiner ce travail

au Ministère Français de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche, à l’Université
Joseph Fourier, à l’ANR, au GFB et à la FEMS, du soutien financier

à Cristina, por haberme iniciado al proyecto YéYé y haber compartido conmigo todo
su saber, por sus cualidades humanas y su amistad, por tantos viernes
a las 20h esperando que el lunes hubiera mejores resultados
à Anne ΔE, de m’avoir appris tellement sur les protéines membranaires et sur la façon de
« rechercher », d’avoir partagé quotidiennement nos doutes, nos espoirs et nos sourires
à Anne-E, de son amitié, de sa force, de son soin quotidien aux JMJ’s
à Catherine, de sa sympathie, de son respect, de son optimisme
à Johanna, de son sourire, de son énergie, de ses encouragements
à Sandrine, d’avoir nuancé le mythe des boucles d’oreille et des colliers assortis
à Saïda, à Marilia, à Ivan, à Cigdem, de m’avoir supportée en tant qu’encadrant
à Matthieu, à Emilie et à Hien-Anh, de renouveler le sang des JMJ’s
aux anciens thésards de Jean-Michel, de leur travail sur BmrA
qui a fortement inspiré et simplifié ce travail

à Iulia, ma fidèle compagne de bureau, de son amitié,
de sa sensibilité, du partage quotidien
à Richard, de sa sensibilité, de sa disponibilité sans faille
à Jean, de ses questions illimitées, de sa naïveté consciente
à Tof, de partager avec moi son enthousiasme pédagogique
et ses réflexions toujours intéressantes
à Julien, de son sourire qui nous manque
à Isabelle et à Céline, de leur aide au quotidien avec un sourire comme devise
à tous les membres du LPM et de l’ancien BMC, de l’opportunité de réaliser
ce travail dans les meilleures conditions matérielles et humaines
à Eva, de nous avoir accueillis à bras ouverts au sein du LPM
à Daniel, des longues discussions scientifiques pleines d’humour qui m’ont
tellement appris, de la motivation pour améliorer les purifications, de
partager avec moi tes questions et de ta patience face aux miennes
à Aurélie, de ton investissement dans le projet des YéYé, de tes précisions précieuses
à Manuela, de renouveler le dynamisme des ABCs à Paris

à l’équipe lyonnaise, Pierre, Fred, Rima, Attilio, Hélène, Sira, des discussions et bons moments
à nos collaborateurs Virginie, Christoph et James, de leur aide et contributions

à Claudine et à Laurence, de leur exemple de gestion et de motivation pleines de couleurs
et à toute l’équipe colorée, du magnifique travail accompli et du plaisir d’en faire partie
aux constructivistes, du questionnement soulevé sur les façons d’enseigner, des
discussions révélatrices, de relancer l’utopie pédagogique et didactique

à Aurore, de tant de dîners, de discussions, de passion
artistique-littéraire, de gaufres partagés
à Magali et à Walter, mes premiers amphitryons à Grenoble,
de votre sympathie et tous ces moments passés ensemble
à Guillaume, de son amitié et des soirées « Vin et France Culture »
a los grasapardos (¿ podrán perdonar esta dolorosa generalizacion ?), a María, a Liva, a Marco,
por la amistad incondicional a pesar del descuido por mi parte

a mis padres, Ramón y Lupe, sin los cuales este documento no habría podido nacer,
por su educación, por tanto amor y tanta esperanza puesta en mí
a los CGCG, por sus ánimos, su empatía, su alegría, por ser mucho más que dos
a los Atienza Badel, por su acogida, su respeto, su cariño
a Ricardo, sustento y motivación cotidianos, por el placer de compartir también la tesis doctoral
Résumé de la Thèse
L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance ») des cellules cancéreuses est souvent
corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP-
binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents

chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues
ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.
Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH
de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici
en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de
membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à
cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En
revanche, nous avons obtenu un niveau important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis
de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les
deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de
transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le
mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH
avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa
caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude
structurale par microscopie électronique.
Mots clés : transporteurs ABC, protéines membranaires, résistance à de multiples drogues,
résistance aux antibiotiques, détergents, protéoliposomes, mécanisme catalytique, hydrolyse de l'ATP

Titre de la Thèse en anglais
Characterization of 2 bacterial ABC ("ATP-Binding Cassette") transporters of unknown function :
YheI/YheH from Bacillus subtilis and Rv1747 from Mycobacterium tuberculosis
Résumé de la Thèse en anglais
The multidrug resistance (MDR) phenotype of cancer cells is often associated with overexpression of
membrane proteins which belong to the large superfamily of ABC ("ATP-binding cassette")
transporters. These proteins couple ATP hydrolysis to the efflux of chemotherapeutic drugs.
Homologous transporters from bacteria have been involved in antibiotic resistance.
Two new bacterial ABC transporters, Rv1747 from Mycobacterium tuberculosis and YheI/YheH from
Bacillus subtilis, putatively involved in antibiotic resistance, have been studied here after heterologous
expression in Escherichia coli and isolation of inverted membrane vesicles. This system has proved
not to be useful for the study of Rv1747, due probably to codon usage differences between E. coli and
M. tuberculosis. By contrast, we reached a high expression level of YheI/YheH which allowed the
characterization of its transport and ATP hydrolysis activities. We thus showed that these two proteins
associate to form a heterodimeric transporter able to efflux several structurally unrelated drugs, and
that the two subunits play different roles in the catalytic mechanism. Finally, we managed to purify
YheI/YheH in high yield, in a functional and stable state, which allowed us to extend its biochemical
characterization and to obtain 2D crystals for structural studies by electron microscopy.
Mots clés en anglais : ABC transporters, membrane proteins, multidrug resistance, antibiotic
resistance, detergents, proteoliposomes, catalytic mechanism, ATP hydrolysis
Rv1747 et YheI/YheH: deux transporteurs ABC bactériens de fonction inconnue 5
6 Carmen GALIAN BARRUECO
TABLE DES MATIERES
Résumé et mots clés.........................................................................................................................5
Table des matières............................................................................................................................7
Liste des figures.............................................................................................................................11
Liste des tableaux..........................................................................................................................13
Abréviations....................................................................................................................................14
INTRODUCTION..............................................................................................................................17
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES...................................................................................................21
Les transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »)...........................................................23
La diversité des transporteurs ABC......................................................................................23
Les domaines nucléotidiques................................................................................................25
Les domaines transmembranaires : leçons des structures 3D.............................................28
Questions ouvertes sur le mécanisme fonctionnel des transporteurs ABC..........................31
Couplage entre cycle hydrolytique et cycle de transport...................................................31
La phosphorylation des transporteurs ABC......................................................................34
Mécanisme catalytique d'hydrolyse...................................................................................34
La Résistance à de Multiples Drogues (MDR).....................................................................36
Le phénomène MDR et les transporteurs ABC humains......................................................36
La résistance à de multiples antibiotiques et les pompes à efflux bactériennes..................38
Transporteurs ABC MDR chez les procaryotes....................................................................41
Les mystères des transporteurs de multiples drogues.........................................................45
La reconnaissance de multiples drogues dévoilée ?........................................................46
D'autres rôles physiologiques pour les transporteurs de multiples drogues ?..................49
La bactérie Bacillus subtilis..................................................................................................51
La sporulation........................................................................................................................52
Les systèmes de transduction à deux composants..............................................................53
La réponse stringente...........................................................................................................55
Les transporteurs de drogues chez Bacillus subtilis.............................................................57
Les transporteurs ABC de drogues chez Bacillus subtilis....................................................58
Le transporteur YheI/YheH de B. subtilis.............................................................................61
YheI/YheH et le stress cellulaire...........................................................................................62
YheI/YheH et la sporulation..................................................................................................64
Rv1747 et YheI/YheH: deux transporteurs ABC bactériens de fonction inconnue 7
Table des matières
La bactérie Mycobacterium tuberculosis.............................................................................65
La paroi cellulaire de M. tuberculosis....................................................................................67
Les sérine/thréonine protéine kinases chez M. tuberculosis................................................68
Les domaines FHA................................................................................................................70
Les transporteurs de drogues chez M. tuberculosis.............................................................73
Les transporteurs ABC de drogues chez M. tuberculosis.....................................................74
Le transporteur Rv1747 de M. tuberculosis.........................................................................76
La phosphorylation de Rv1747 par PknF..............................................................................78
Rôle physiologique de Rv1747 et PknF................................................................................79
MATERIELS ET METHODES..........................................................................................................81
Biologie Moléculaire...............................................................................................................83
Souches bactériennes.......................................................................................................83
Conditions de culture.........................................................................................................83
Techniques de Biologie Moléculaire.....................................................................................84
Préparation et transformation de bactéries compétentes.................................................84
Préparation d'ADN plasmidique........................................................................................84
Electrophorèse des fragments d'ADN...............................................................................85
Restriction et ligation..........................................................................................................86
Amplification d'ADN par PCR (polymerase chain reaction)..............................................86
Constructions........................................................................................................................87
Oligonucléotides................................................................................................................87
Plasmides utilisés..............................................................................................................88
Clonages et sous-clonages...............................................................................................88
Mutagenèse dirigée...........................................................................................................89
Délétion des gènes yheI et yheH......................................................................................91
Préparation de protéines recombinantes.............................................................................92
Surproduction analytique......................................................................................................92
Expression hétérologue chez Escherichia coli..................................................................92
Expression en système acellulaire....................................................................................93
Tests de solubilité et d'adressage à la membrane............................................................93
Surproduction préparative.....................................................................................................94
Préparation de vésicules de membrane inversées...........................................................94
Purification de YheI/YheH.................................................................................................95
Concentration des protéines.............................................................................................96
Dosage des protéines...........................................................................................................96
Méthode modifiée de Lowry..............................................................................................96
Dosage de Bradford..........................................................................................................97
Détection des protéines........................................................................................................98
8 Carmen GALIAN BARRUECO
Table des matières
Electrophorèse des protéines sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)...........................98
Détection de protéines par immunorévélation...................................................................99
Chromatographie d'exclusion de taille................................................................................100
Reconstitution des protéines en liposomes........................................................................101
Méthodes d'étude fonctionnelle..........................................................................................104
Mesures d'activité ATPase..................................................................................................104
Préparation des solutions concentrées d'ATP et d'orthovanadate.................................104
Dosage de l'ADP produit par la réaction.........................................................................104
Dosage du phosphate inorganique produit par la réaction.............................................105
Mesures de transport de drogues.......................................................................................106
Transport de drogues dans des cellules.........................................................................107
Transport de drogues par des vésicules de membrane inversées.................................107
Mesures de sensibilité aux antibiotiques............................................................................109
Méthode de diffusion en milieu solide.............................................................................109
Méthode de dilution en milieu liquide..............................................................................109
RESULTATS ET DISCUSSION.....................................................................................................111
L'expression recombinante de Rv1747..............................................................................113
L'hypothèse de la dégradation protéolytique......................................................................114
L'hypothèse de l'arrêt traductionnel....................................................................................118
Etude de Rv1747 dans des vésicules membranaires.......................................................121
YheI/YheH : un transporteur ABC hétérodimérique..........................................................125
Le chevauchement génique................................................................................................125
Expression hétérologue de YheI et YheH chez E. coli.......................................................128
YheI et YheH forment « une ATPase » hétérodimérique...................................................129
YheI et YheH interagissent physiquement..........................................................................130
YheI/YheH : un transporteur ABC de multiples drogues..................................................132
Mesures de transport dans des vésicules de membrane inversées (IMVs).......................132
Mesures de transport dans des cellules.............................................................................135
Quelle fonction physiologique pour YheI/YheH ?.............................................................137
YheI/YheH et les antibiotiques............................................................................................137
L'atténuation transcriptionnelle : implication des antibiotiques ?........................................142
YheI/YheH et le stress cellulaire.........................................................................................146
YheI/YheH et la sporulation................................................................................................148
Purification de l'hétérodimère YheI/YheH..........................................................................150
Le choix du détergent..........................................................................................................151
Activité, homogénéité et stabilité de YheI/YheH purifié......................................................154
Rv1747 et YheI/YheH: deux transporteurs ABC bactériens de fonction inconnue 9
Table des matières
Analyse par chromatographie d'exclusion de taille.........................................................155
Etude de l'activité ATPase...............................................................................................156
Analyse par ultracentrifugation analytique......................................................................157
Cristallisation de YheI/YheH...............................................................................................159
Purification séparée des sous-unités YheI et YheH...........................................................161
Reconstitution du transporteur YheI/YheH........................................................................163
Le choix des lipides.............................................................................................................163
Le choix du détergent..........................................................................................................165
Rapport lipide:protéine, détergent:lipide et orientation des protéines................................167
Activité ATPase de YheI/YheH reconstitué.........................................................................169
Bilan des différentes mesures.........................................................................................169
Constantes cinétiques de l'hydrolyse de l'ATP par YheI/YheH.......................................170
Etude des mutants catalytiques de YheI/YheH.................................................................172
Mutagenèse de la lysine conservée du motif A de Walker.................................................173
Mutagenèse de l'histidine conservée de l'H-loop................................................................176
Mutagenèse du carboxylate « catalytique »........................................................................178
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES..........................................................................................181
ANNEXES......................................................................................................................................185
Annexe A : Différentes familles d'antibiotiques................................................................187
Annexe B : Le traitement de la tuberculose.......................................................................193
Annexe C : Antiseptiques et cations quaternaires...........................................................195
Annexe D : Colorants fluorescents.....................................................................................196
Liste des structures chimiques détaillées dans les Annexes A-D..................................197
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.........................................................................................199
Communications et Publications................................................................................................231

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