Capping apparatus in yeast

216 Pages·2011·10.61 MB·English

Univerzita Karlova v Praze
Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie

Znak

Mgr. Zuzana Feketová

S čiapočkou alebo bez čiapočky?
Iniciácia translácie eukaryotov so zameraním na oportúnneho patogéna C. albicans.
To cap or not to cap?
Eukaryotic translation initiation with a special interest in human opportunistic pathogen
C. albicans

Disertační práce

Školitel: RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D.

Praha, 20.5.2011

Prohlášení:
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval/a samostatně a že jsem uvedl/a
všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část
nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze, 30.5.2011

Podpis

Poďakovanie
Moja cesta k štúdiu molekulárnej biológie rozhodne nebola priamočiara, a ani počas štúdia
a spisovania doktorskej dizertačnej práce som sa nevyhla nečakaným zákrutám a odbočkám. Našťastie
som stretla mnoho skvelých ľudí, ktorý mi pomohli nájsť správny smer, keď som si myslela, že som sa
nadobro stratila. Na tomto mieste by som sa rada poďakovala.
Moja vďaka patrí hlavne skvelému školiteľovi Dr. Martinovi Pospíškovi, ktorý pomôže vždy, keď
môže (a mám dojem, že občas aj keď už nemôže). Nielen jeho odborné rady, ale aj ľudský a osobný
prístup k všetkým členom laboratória pomáhali celú dobu môjho štúdia vytvárať skvelú pracovnú
atmosféru, na akú sa nezabúda. Pane doktore, ďakujem za trpezlivosť, čas, dobrú náladu
a povzbudenie. Ďakujem za všetku 'vedu', čo som si vďaka vám natlačila do hlavy.
Bez skvelých kolegov, čo sú ochotní pomôcť a vypočuť, rozosmiať v čase, keď je každý deň 'deň
blbec' by to nešlo. V kolektíve Laboratoře biologie RNA som našla skvelých priateľov, ľudí
s otvorenou hlavou, skvelých vedcov, od ktorých sa je vždy čo naučiť, a ktorí sú ochotní pomôcť.
Chcela by som poďakovať menovite kolegom bývalým: Petre Sekyrovej, Martine Pejznochovej, Míši
Svobodovej, Denise Kovářovej, Dane Kopperovej, Martinovi Mokrejšovi, Jirkovi Černému a Jitke
Dubskej. Ale najmä kolegom terajším, ktorí so mnou prežívali aj nedávne mesiace spisovania
doktorskej dizertačnej práce. Ďakujem Vaškovi Vopálenskému a Tomášovi Maškovi, na ktorých sa dá
vždy spoľahnúť, skvelým priateľkám Katke Mocovej, Silvii Mrvovej, Denise Dolečkovej a Ivane
Hruškovej. Baby, bez vás už by to Nuselák dávno zaistil. Dobrých priateľov a skvelých kolegov som
našla aj v Pepovi Novákovi, Lucke Holáskovej, Kristíne Roučovej, Anasovi Ahmadovi Khawaja a vo
všetkých ostatných členoch nášho kolektívu. Poďakovanie patrí aj laborantke Vlaste Pelechovej, ktorá
občas robí zázraky na počkanie, a keď to nejde, tak aspoň človeku 'strčí granát do huby'.
Špeciálne poďakovanie bezpochyby patrí aj kolektívu v laboratóriu v Aarhuse, kde som strávila
štyri plodné a krásne mesiace, veľmi rada na to obdobie spomínam. Dr. Rom Gregers Andersen aj
Dr. Klaus Hvid Nielsen boli skvelými učiteľmi a radcami.
Ešte jedno veľké ďakujem Ivane Hruškovej, za rozpravy o našom rodnom jazyku pri spisovaní
mojej dizertačnej práce.
Veľké ďakujem patrí aj Dr. Gustávovi Russovi, pod ktorého vedením som sa zamilovala do vedy.
Nakoniec by som chcela poďakovať rodine, priateľom a partnerovi, nie vždy je to so mnou ľahké,
najmä keď nevychádzajú pokusy. Ďakujem za podporu a trpezlivosť. Najväčšie ĎAKUJEM patrí na
záver mojej mame, bez ktorej by som práve teraz asi sedela v archíve a študovala druhú svetovú, alebo
vykopávala (v tom lepšom prípade) zasa raz voľajaký prastarý kus črepu zo zeme niekde na kraji
sveta. Mami, neviem, ako si to vedela, keď ja sama som to nevedela, ale si skvelá.

Abstrakt
Candida albicans je bezpochyby veľmi dôležitý oportúnny patogén, ohrozujúci hlavne
imunokompromitovaných pacientov. Pokiaľ viem, ide o jediný organizmus, ktorý je schopný prežívať
s nemetylovanými čiapočkami nachádzajúcimi sa na 5´konci mRNA. Funkčnou analýzou som
potvrdila, že orf19.7626 kóduje translačný iniciačný faktor 4E C. albicans (Ca4E). Predpoklad, že
Ca4E proteín by mohol rozpoznávať nemetylované čiapočky, sa nám v modelovom organizme
S. cerevisiae nepodarilo potvrdiť.
Rod Candida má však aj ďalšiu zvláštnosť- dvojaké dekódovanie CUG kodónu. Vo veľkej väčšine
prípadov je dekódovaný ako serín, ale môže ísť aj o leucín, takže vzniká tzv. "štatistický proteóm".
Jeden takýto kodón je aj súčasťou mRNA Ca4E proteínu. U C. albicans by sa teda mohli vyskytovať
súčasne dve varianty Ca4E - Ca4ELeu a Ca4ESer. Obe formy dokážu nahradiť eIF4E S. cerevisiae, ale
spôsobujú termosenzitívny fenotyp, ktorý je výraznejší v prípade Ca4ELeu proteínu.
Zmiernenie termosenzitívneho fenotypu sa podarilo docieliť koprodukciou Ca4E spolu s C. albicans
eIF4G proteínom (Ca4G). Úlohou eIF4G je prepojiť mRNA s 43S podjednotkou ribozómu pomocou
interakcie s eIF4E, ktorá zároveň zvyšuje afinitu eIF4E k čiapočke. Preto sa domnievam, že interakcia
Ca4E s eIF4G proteínom S. cerevisiae nie je dostačujúca. Ca4G taktiež obsahuje jeden CUG kodón,
ktorý však nemá v našom modelovom organizme vplyv na fenotyp.
Ca4ELeu je menej stabilný aj pri purifikácii z baktérií, preto som pri kryštalografických pokusoch
pracovala hlavne s Ca4ESer. Mikrokryštály, ktoré bude potrebné ešte optimalizovať, sa mi podarilo
pripraviť z komplexu Ca4ESer s analógom čiapočky a komplexu "trunc.4E•m7GpppG•eIF4GHis
peptid". Odstránenie neštruktúrovaného N-konca z eIF4E proteínu (trunc.4E) by malo zlepšiť rast
kryštálov.
Proteín kódovaný v C. albicans génom orf19.3914 vzdialene pripomína Ca4E, ale v S. cerevisiae sa
ako funkčný eIF4E proteín nechová. Sám o sebe pravdepodobne nie je schopný zabezpečiť iniciáciu
translácie mRNA molekúl s nemetylovanými čiapočkami, nakoľko nekomplementuje deléciu génu
RNA metyltransferázy u S. cerevisiae.
V priebehu doktorského štúdia som sa venovala aj projektu zameraného na výskum IRES elementov,
v rámci ktorého som sa stala spoluautorkou dvoch priložených publikácií.

Kľúčové slová: čiapočka, eIF4E, C. albicans, CUG, IRES, databáza, HCV
Abstract
Candida albicans belongs to serious human opportunistic pathogens, causing severe health
complications to immunocompromised patients. To my best knowledge, it is the only organism that
survives with unmethylated cap structures found on the 5´ends of mRNA molecules. Using functional
assay, I demonstrated that orf19.7626 codes for C. albicans translation initiation factor 4E (Ca4E). We
couldn´t prove our hypothesis, that Ca4E could be responsible for the unmethylated cap recognition in
our model organism S. cerevisiae.
Candida sp. possesses also another rather unusual feature – ambiguous CUG codon. In most of the
cases, CUG is decoded as a serine, but sometimes also as a leucine. This gives rise to a so called
"statistical proteome". One CUG codon is also part of the mRNA coding for Ca4E protein, therefore
two versions of Ca4E—Ca4ELeu and Ca4ESer—might occur in C. albicans simultaneously. Both of
them are able to rescue deletion of S. cerevisiae eIF4E gene, but they confer temperature sensitivity to
the heterologous host. This phenotype is more pronounced with the Ca4ELeu version.
We observed milder temperature sensitive phenotype after co-expression of Ca4E together with
C. albicans eIF4G (Ca4G). Conformational coupling between eIF4E and eIF4G leads to enhanced
affinity of eIF4E to the cap structure and facilitates connection of mRNA with 43S ribosome subunit.
It is therefore possible, that heterologous interaction of Ca4E with S. cerevisiae eIF4G is not able to
fully supply these functions. Ca4G also contains one CUG codon, which doesn´t have impact on any
phenotype in our model system.
Ca4ELeu is also less stable when purified from bacterial cultures; therefore I used predominantly the
Ca4ESer protein for the crystallography trials. I was able to prepare microcrystals from 2 complexes:
Ca4ESer•m7GTP and "trunc.4E•m7GpppG•eIF4GHis peptid". However, both of them need to be further
optimized. I employed shorter Ca4E version as truncation of the unstructured N-terminus from Ca4ESer
(trunc.4E) should enhance crystal growth.
Protein encoded by C. albicans orf19.3914 loosely resembles the Ca4E factor, but doesn’t behave as
such in S. cerevisiae. It is also not able to rescue growth of S. cerevisiae strains defective in mRNA
capping. I conclude that this protein alone cannot bind unmethylated cap structures.
During my PhD studies, I also took part in research devoted to IRES elements and became a co-
author of two enclosed publications.

Key words: cap, eIF4E, C. albicans, CUG, IRES, database, HCV
Táto práca bola podporovaná grantami:
Grantová agentura UK: GAUK 190/2005/B-BIO/PrF
Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy ČR: LA10023 Zapojení českých vědců do
aktivit mezinárodních vědeckých společností The RNA Society, The Society for General
Microbiology a FEMS
LC06066 - Centrum environmentální mikrobiologie
MSM0021620858 Signalizace a molekulární mechanismy buněčné odpovědi

Ďakujem spoločnosti FEMS a Československej Spoločnosti Mikrobiologickej za udelenie
FEMS Research Fellowship pre projekt ―X-ray co-crystallographic study of the eIF4E-eIF4G
complex and reconstitution of the eIF4F translation initiation complex‖