Brucelosis crónica y persistencia de ADN de Brucella melitensis

231 Pages·2010·1.98 MB·Spanish

FACULTAD DE MEDICINA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN
Departamento de Medicina Laboratorio de Biología Molecular

Brucelosis crónica y persistencia de ADN de
Brucella melitensis

Tesis Doctoral
María Jesús Castaño Aroca

Madrid 2010

Directores de tesis:
Dr. Francisco Arnalich Fernández
Dr. Javier Solera Santos

El trabajo que se describe en esta memoria ha sido realizado en la Unidad de
Investigación del Hospital General Universitario de Albacete, bajo la dirección del Dr.
Francisco Arnalich Fernández y del Dr. Javier Solera Santos, gracias a una beca de la
Consejería de Sanidad de la Junta de Comunidades de Castilla La-Mancha (JCCM) para
Jóvenes Investigadores (MOV-2007_JI/05), a la Red Temática: “Red para la
investigación de la Brucelosis” (G03/204) financiada por el Fondo de Investigación
Sanitaria y a los proyectos de investigación PI2006/43 y PI2007/27 de la JCCM.
Agradecimientos
He tenido la suerte de contar con los doctores Javier Solera Santos en Albacete y
Francisco Arnalich Fernández en Madrid. A Javier, que me dio la oportunidad de empezar a
desarrollar este trabajo, gracias por confiar siempre en mi y por contagiarme tu incansable
curiosidad científica. A Francisco, mi más sincero agradecimiento por tu amabilidad,
disponibilidad y buen criterio.
Gracias a mi compañera de viaje, la Dra. Elena Navarro García, porque después de
todos los momentos vividos me quedo con los buenos recuerdos. Gracias por todo lo que me
has enseñado dentro y fuera del laboratorio y por mostrarme siempre tu apoyo y el lado
positivo de la vida.
Con cariño deseo dar las gracias por su consejo, su buen juicio, apoyo y experiencia a la
Dra. Dolores García Olmo. Gracias por todo lo que has hecho por mí desde un principio y por
la desinteresada revisión final de este manuscrito.
Gracias al Dr. Carlos de Cabo por tenderme una mano con las traducciones siempre
que lo he necesitado.
Gracias al personal médico y de enfermería de la Unidad de Enfermedades Infecciosas
y del Servicio de Medicina Interna del CHUA por esa tediosa recogida de muestras, en
especial a Mª José Andicoberry, por su simpatía y paciencia y a Juan Carlos Segura por los
buenos momentos compartidos. El próximo eres tú, ¡mucho ánimo!.
Gracias al Dr. Ramón Díaz, del Hospital Universitario de Pamplona y a los laboratorios
Vircell S.L, por la ayuda prestada en la realización de algunas pruebas serológicas.
Gracias a mis compañeros y amigos presentes y pasados de la Unidad de Investigación,
Ángel A. Arriaga, Antonio Rubio, Gemma Serrano, José M. Godínez, Julia Samos, Leticia
Serrano, María G. Picazo, Mónica Gómez-Juárez y Pedro J. Benito por esas sonrisas y
lágrimas compartidas, por vuestros ánimos y consejos, por enseñarme todo lo que sabeis, por
esos sustos en el mortuorio, por coronarme “Miss melitensis” y mucho más. Quisiera destacar
el excelente trabajo técnico de María G. Picazo, porque sin tu ayuda ¡todavía estaría
extrayendo muestras!.
Gracias también a esos maravillosos diseñadores gráficos que son mis tíos Pepe Catalán
y Raquel Aroca, por la portada de esta Tesis.
Gracias a mis amigas de toda la vida, a mis primas y a Luis, por escucharme cuando lo
he necesitado y mostrarme tantos gestos de cariño y admiración.

A mi madre y mi hermana, por confiar en mi y
quererme tanto, porque sin vuestro apoyo no
hubiera llegado hasta aquí. A toda mi familia y en
especial a mi hermano y Mada y sus dos joyitas,
mis sobrinos Manuel y Martín. A todos, por
hacerme tan feliz.

INDICE
RESUMEN 15
INTRODUCCIÓN 17
HISTORIA DE LA BRUCELOSIS 19
EPIDEMIOLOGÍA 21
VÍAS DE TRANSMISIÓN 21
DISTRIBUCIÓN MUNDIAL 22
GÉNERO BRUCELLA SPP. 23
CARACTERÍSTICAS GENERALES 23
GENOMA 24
ENVOLTURA CELULAR 26
TAXONOMÍA 28
INMUNOLOGÍA Y PATOGÉNESIS 30
MECANISMOS DE PENETRACIÓN INTRACELULAR 31
MECANISMOS DE SUPERVIVENCIA INTRACELULAR 32
ANERGIA EN LOS PACIENTES CON BRUCELOSIS CRÓNICA 34
MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y ENFERMEDAD LOCALIZADA 35
BRUCELOSIS AGUDA 36
BRUCELOSIS SUBAGUDA 37
BRUCELOSIS SUBCLÍNICA O ASINTOMÁTICA 37
BRUCELOSIS RECIDIVANTE 37
ENFERMEDAD LOCALIZADA 38
BRUCELOSIS CRÓNICA 42
DIAGNÓSTICO DE LA BRUCELOSIS HUMANA 44
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO 44
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO 46
Rosa de Bengala 47
ix
Seroaglutinación 48
Prueba de Coombs anti-Brucella 49
Otras pruebas serológicas 49
DIAGNÓSTICO MOLECULAR 50
Ensayos de PCR convencional 51
Ensayos de PCR en tiempo real 55
TRATAMIENTO DE LA BRUCELOSIS HUMANA 57
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 61
MATERIAL Y MÉTODOS 65
DISEÑO DEL ESTUDIO 67
SUJETOS 67
GRUPO CONTROL 67
GRUPO DE ESTUDIO 68
Proceso de selección 69
Criterios de inclusión 69
Criterios de exclusión 70
PROTOCOLO GENERAL DE ESTUDIO 70
TOTAL DE MUESTRAS ANALIZADAS 71
MATERIAL Y EQUIPAMIENTO DE LABORATORIO 71
PROCESAMIENTO INICIAL DE MUESTRAS 73
PROTOCOLOS DE LAS PRUEBAS DE LABORATORIO 73
HEMOCULTIVO, SEROAGLUTINACIÓN Y COOMBS ANTI-BRUCELLA 73
ROSA DE BENGALA 74
BRUCELLACAPT® 75
EXTRACCIÓN DE ADN 76
ENSAYO DE PCRQtr 78
Cebadores y sonda TaqMan 78
Mezcla de reacción 81
Condiciones de amplificación 81
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