Bioreaktionstechnik: Bioprozesse mit Mikroorganismen und Zellen: Prozeßüberwachung

433 Pages·1997·26.698 MB·German

by  Prof. Dr. K. Schügerl (auth.)

K. Schügerl
Bioreaktionstechnik:
Bioprozesse mit Mikroorganismen
und Zellen
Prozeßüberwachung
Springer Basel AG
Autor:
Prof. Dr. K. Schügerl
Institut für Technische Chemie der Universität Hannover
Callinstrasse 3
D-30167 Hannover
Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme
Schügerl, Karl:
Bioreaktionstechnik: Bioprozesse mit Mikroorganismen und Zellen :
Prozeßüberwachung / K. Schügerl. - Basel; Boston ; Berlin : Birkhäuser, 1997
ISBN 978-3-7643-5682-8 ISBN 978-3-0348-8888-2 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-0348-8888-2
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© 1997 Springer Basel AG
Ursprünglich erschienen bei Birkhäuser Verlag AG, Basel, Schweiz 1997
Umschlaggestaltung: Micha Lotrovsky, Therwil, Schweiz
Gedruckt auf säurefreiem Papier, hergestellt aus chlorfrei gebleichtem Zellstoff. TCF <~
ISBN 978-3-7643-5682-8
987654321
Inhaltsverzeichnis
Vorwort XI
Einleitung ................................................................................................................. .
2 Allgemeine Grundlagen und Methoden ............................. ... ............ .......... ........... 5
2.1 Überwachungstechniken von Bioprozessen ........ ... ............................. ................. ...... 5
2.1.1 In-situ-Messung der Kontrollvariablen ................................................................ 5
2.1.1.1 Temperatur ............ .......... ................. ........................................ ......... ............ 6
2.1.1.2 Druck ............................................................................................................. 6
2.1.1.3 Flüssigkeitsniveau und -gewicht ................... ... ................... .................... ...... 6
2.1.1.4 Flüssigkeits-und Gasdurchsatz .... .................................. ......................... ...... 7
2.1.1.5 Rührerdrehzahl und Leistungseintrag ........................................................... 8
2.1.1.6 pH-Wert des Mediums .................................................................................. 9
2.1.2 In-situ-Messung der Zustandsvariablen ............................................................... 11
2.1.2.1 Gelöstsauerstoffkonzentration im Medium ................................................... 12
2.1.2.2 Gelöstkohlenstoffdioxidkonzentration im Kultivierungsmedium ................. 15
2.1.2.3 Redoxpotential in Kultivierungsmedien ........................................ ...... .......... 15
2.1.2.4 Bestimmung der Ionenkonzentrationen in Kultivierungsmedien .. ...... .......... 17
2.1.2.5 Bestimmung der Abgaszusammensetzung ........................................ ............ 18
2.1.2.6 Bestimmung der Konzentration und des biologischen Zustandes der
Zellen ............................................................................................................. 19
2.1.3 Sterile On-line-Probenahme und Proben vorbereitung ......................................... 29
2.1.3.1 Zellfreie Mediumentnahme mit einem Querstrom-Filtrationsmembran-
Modul, integriert in eine Mediumrückführschlaufe ............... ................... .... 31
2.1.3.2 In-situ-Membranfilter für die Probeentnahme zellfreier Medien .................. 35
2.1.3.3 In-situ-Probeentnahme von zellhaItigern Medium ........................................ 39
2.1.3.4 Probeentnahme gelöster Gase und flüchtiger Mediumkomponenten ....... ..... 40
2.1.3.5 Probenvorbereitung ....................................................................................... 42
2.1.4 On-line-Analysentechniken ................................................................................. 43
2.1.4.1 Die kontinuierliche Fließanalyse (Continuous flow analysis, CFA) ............. 44
2.1.4.2 Fließinjektionsanalyse FIA ............................................................................ 46
2.1.4.3 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC) .............. ......... ...................................... ................. 53
2.1.4.4 Schnelle-Protein-Flüssigkeits-Chromatographie (Fast Protein Liquid
Chromatography, FPLC) ... ........ ................................... ................ ......... ........ 57
VI
2.1.4.5 Die Ionen-Chromatographie (IC) ................................................................. . 58
2.1.4.6 Membran-Chromatographie (MC) ............................................................... . 59
2.1.4.7 Kapillar-Elektrophorese (CE) ....................................................................... . 60
2.1.4.8 Gaschromatographie (GC) ........................................................................... . 62
2.1.4.9 Überkritische Fluid-Chromatographie (Supercritical-Fluid-
Chromatography, SFC) ................................................................................ . 64
2.1.4.10 Massenspektrometrie (MS) .......................................................................... . 64
2.1.5 Die Off-line-Analyse von Schlüsselparametem ................................................ .. 68
2.1.5.1 Vermeidung von Infektionen (Sterilitätstest) .............................................. .. 68
2.1.5.2 Meßmethoden zur Bestimmung von Zellgröße, Lebendzellzahl,
Zellmorphologie ........................................................................................... . 69
2.1.5.3 Rheologie des Kultivierungsmediums .......................................................... . 75
2.1.5.4 Intrazelluläre Zellkomponenten ................................................................... . 77
2.1.5.5 Plasmidzahl und Plasmidstabilität ............................................................... .. 83
2.1.5.6 Spezielle analytische Methoden ................................................................... . 84
3 Anwendung der allgemeinen Techniken für individuelle Bioprozesse .............. .. 89
3.1 Kultivierung von Saeeharomyees eerevisiae ............................................................ . 91
3.1.1 Die Überwachung des Prozesses ......................................................................... . 95
3.1.1.1 Die Festlegung der Mediumzusammensetzung .................................................. . 95
3.1.1.2 Die Bestimmung der Gaszusammensetzung ................................................ . 98
3.1.1.3 Bestimmung der Zellkonzentration und Feststellung ihres Zustandes 99
3.1.1.4 Fluiddynamisches Verhalten des Mehrphasensystems im Bioreaktor .......... 99
3.1.2 Beispiele für die Prozeßüberwachung ........ ............ ............ .................................. 100
3.1.2.1 Satzkultivierung ............................................................................................. 103
3.1.2.2. Kontinuierliche Kultivierung ........................................................................ 107
3.1.2.3 Zellzyklus und Synchronwachstum ............................................................... 112
3.1.3 Prozeßsimulierung im Laboratorium. Scale-down Messungen ........................... 123
3.1.4 Maßstabvergrößerung (scale-up) des Reaktors .................................................... 127
3.1.5 Ökonomische-, ökologische-und Sicherheitsaspekte .......................................... 135
3.2 Die Produktion von Fusionsprotein mit rekombinanten Eseheriehia eoli
Bakterien .................................................................................................................... 141
3.2.1 Die Prozeßüberwachung ...................................................................................... 143
3.2.1.1 Die Überwachung der Mediumzusammensetzung ........................................ 144
3.2.1.2 Die Bestimmung der Zellkonzentration und die Charakterisierung der
Zellen ............................................................................................................. 152
3.2.2 Kultivierung von rekombinanten E. eoli und Produktion von EcoRI und
Fusionsprotein EcoRI::SPA ................................................................................. 155
3.2.2.1 Satzkultivierung von E. eoli JM103 (System C) ........................................... 155
Vll
3.2.2.2 Zulauf-Satzkultivierung von E. coli 1M 103 ................................................. 158
3.2.3 Ökonomische-, ökologische-und Sicherheitsaspekte .......................................... 161
3.3 Alkalische Proteaseproduktion mit Bacillus licheniformis ................ ............. ........... 166
3.3.1 Die Prozeßüberwachung ...................................................................................... 166
3.3.2 Satz-und Zulauf-Satzkultivierungen ................................................................... 179
3.3.3 Ökonomische-, ökologische-und Sicherheitsaspekte .......................................... 184
3.4 Die Produktion von Antibiotika mit Pilzen und Streptomyceten ....... ................ ........ 186
3.4.1 Analytische Prozeßüberwachung ......................................................................... 186
3.4.1.1 Produktion von Penicillin mit Penicillium chrysogenum ...... ............... ......... 186
3.4.1.2 Produktion von Cephalosporin C mit Acremonium chrysogenum
(Cephalosporium acremonium) .. ................................. ............... .............. ..... 204
3.4.1.3 Produktion von Tetracyclin mit Streptomyces aureofaciens ............. ............ 214
3.4.1.4 Vergleich der Produktion der drei Antibiotika in Rührkessel-und
Mammut-Säulen-Schlaufen (ATL)-Reaktoren .............................................. 220
3.4.1.5 Bilanzierung der Tetracyclinproduktion ........................ ................... ............ 224
3.4.2 Ökonomische-, ökologische-und Sicherheitsaspekte .......................................... 230
3.5 Kontinuierliche Produktion von Primärmetaboliten mit suspendierten und
immobilisierten Mikroorganismen ........... ............................... ................ .............. ..... 236
3.5.1 Prozeßüberwachung ............................................................................................. 237
3.5.2 Charakterisierung der immobilisierten Zell systeme ....... .................. ................ ... 238
3.5.2.1 Kontinuierliche Kultivierung von Zymomonas mobilis und Produktion
von Ethanol mit suspendierten bzw. immobilisierten Zellen ...... .................. 239
3.5.2.2 Kontinuierliche Kultivierung von Clostridium acetobutylicum und
Produktion von Aceton und Butanol mit suspendierten sowie
immobilisierten Zellen ....................... ....................................... .... ............ .... 252
3.5.2.3 Kontinuierliche Kultivierung von Lactobazillen: Produktion von
Milchsäure mit suspendierten und immobilisierten Zellen ........... ......... ....... 261
3.5.3 Ökonomische-, ökologische-und Sicherheitsaspekte .......................................... 270
3.6 Kultivierung tierischer Zellen und Produktion von Proteinen ................................... 274
3.6.1 Prozeßüberwachung ............................................................................................. 274
3.6.1.1 Probeentnahme .............................................................................................. 275
3.6.1.2 Perfusionssysteme ......................... ........................................... ........... .......... 277
3.6.1.3 Überwachung der Konzentration und Eigenschaften der Zellen ........... ........ 280
3.6.1.4 Überwachung der Zusammensetzung des Nährmediums und der
Konzentrationen der Metaboliten ............. ............................... ............ .......... 283
3.6.1.5 Überwachung der Enzymaktivität .................................... ............... ......... ..... 284
3.6.1.6 Überwachung der Produktkonzentration ............................... ............. ........... 285
3.6.1.6.1 FIA-Immunoassays ....................................................................................... 285
3.6.1.6.2 Chromatographische Methoden .............................. ................ ......... ....... 286
vm
3.6.1.6.3 Massenspektrometrische Methoden ............ ........................................ .... 287
3.6.1.6.4 Optische spektroskopische Methoden ... ................. ....................... ......... 289
3.6.1.6.5 Dynamische Lichtstreuung (DLS) .......................................................... 290
3.6.1.7 Kultivierung von BHK-und CHO-Zellen und Produktion von
ß-Galactosidase und Antithrombin m ...... ......................................... ........... 290
3.6.1.8 Kul~i~~erung von Hybridomzellen und die Produktion monoklonaler
AntIkorper ................ ...................... ................ ............................................... 297
3.6.1.9 Kultivierung von Spodoptera jrugiperda Zellen und Produktion von
ß-Galactosidase .. ........................ .................. ........................... .... .................. 300
3.6.2 Ökonomische-, ökologische-und Sicherheitsaspekte .......................................... 312
3.7 Anaerobe Abwasserbehandlung ................................................................................. 315
3.7.1 Prozeßüberwachung ............................................................................................. 318
3.7.1.1 Bestimmung der Zellkonzentration und -aktivität .............................. ........... 318
3.7.1.2 Analyse der flüssigen Phase ....... ............... ....................... ....... .................. .... 320
3.7.1.3 Analyse der Gasphase ................................................................................... 323
3.7.2 Biogasproduktion aus Molke und Kohlenstoffbilanzierung ............................ .... 323
3.7.3 Modellierung ........................................................................................................ 328
3.4.7 Biogasproduktion aus Rindergülle ....................................................................... 331
3.7.5 Ökonomische-, Ökologische-und Sicherheitsaspekte ......................................... 335
4 Neue Entwicklungen ............. ..... ............... ................ ................ ......... ............. .......... 339
4.1 Prozeßüberwachung ......... ............. ............... ................ .............................................. 339
4.1.1 Schnelle Probeentnahme für die Analyse intrazellulärer Metabolite ........ ........... 339
4.1.2 In-situ-Scanning-Fluorometrie für die Überwachung von
Kultivierungsprozessen .................. .................. ........................ ....... ............. ........ 340
4.2 Bildanalyse von Zellen und Zellaggregaten ............................................................... 342
4.2.1 In-situ-Mikroskopie der Zellen und Zellaggregate .............................................. 342
4.2.2 Ex-situ-Mikroskopie und Bildanalyse der Zellen und Zellaggregate .................. 344
4.2.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ...................................................... 349
4.2.4 Elektronmikroskopische Untersuchungen ........................................................... 353
4.3 Ermittlung experimenteller Daten für die Berechnung der Stoffwechselflüsse in
Mikroorganismen und tierischen Zellen ..................................................................... 358
4.4 Signalauswertung, Automatisierung und Expertensysteme für die
Prozeßüberwachung ..................... ............... .................... ........................... .... ............ 361
5 Literaturverzeichnis ........ .................... .................. ........................................ ........... 367
5.1 Literaturverzeichnis zu Kapitel 2 ............................................................................... 367
5.2 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.1 ............................................................................ 384
5.3 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.2 ............................................................................ 387
IX
5.4 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.3 389
5.5 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.4 391
5.6 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.5 395
5.7 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.6 400
5.8 Literaturverzeichnis zu Kapitel 3.7 405
5.9 Literaturverzeichnis zu Kapitel 4 ...... ............................... ............ .............................. 408
Anhang ............................................................................................. 413
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................ 413
Griechische Buchstaben ........................................................................... 417
Schlagwortverzeichnis ............................................................................. 419
Vorwort
Die genaue Überwachung der Bioprozesse ist die Voraussetzung für ihre Systemanalyse, mathe
matische Modellierung, Regelung und Dokumentation. Trotz dieser wichtigen Rolle wurden die
modemen Methoden der Bioprozeßüberwachung bisher noch nicht zusammenfassend dargestellt.
Im vorliegenden Buch werden die allgemeinen und speziellen Meßmethoden, die für die Prozeß
überwachung von Bedeutung sind, beschrieben und ihre Anwendung für typische Bioprozesse bei
spielhaft dargestellt.
Die vorgestellten Beispiele für die Bioprozeßüberwachung wurden in den letzten zehn Jahren
durchgeführt und sollen die besonderen Probleme der Prozeßüberwachung aufzeigen. Wegen der
schnellen Entwicklungen auf diesem Gebiet sind inzwischen einige der verwendeten Instrumente
und Software für die Prozeßüberwachung überholt, lassen sich aber leicht durch modernere erset
zen. Die allgemeinen Erfahrungen mit diesen Systemen sind jedoch dazu geeignet, dem Leser
behilflich zu sein, seine Prozeßüberwachungsprobleme zu lösen.
Weiterhin wurden die Hersteller der verwendeten Instrumente und ihre Adressen in diesem Buch
angegeben. Einige Firmen haben ihre Namen mehrmals gewechselt. Z.B. wurde der bekannte
Instrumenthersteller Dr. INGOLD an METTLER-TOLEDO verkauft, eine Tochter der Fa. CIBA
GEIGY, die später an AEA INVESTORS, INC, NEW YORK veräußert wurde. Es ist zu erwarten,
daß der Name METTLER-TOLEDO in Kürze wiederum geändert wird. Daher wurde im Buch
weiterhin der Name INGOLD verwendet.
Frau Anneliese Schrader und Frau Anna-Maria Gieseke wird für ihre Mitwirkung bei der Fertig
stellung des Buches und Herrn Prof. D. Hesse für die Korrektur des Buchtextes gedankt.
K. Schügerl
1 Einleitung
Industrielle Produktionsprozesse bestehen aus mehreren Stufen: Aufbereitung der Edukte, ihre Um
setzung, sowie Gewinnung und Reinigung der Produkte.
Das gleiche gilt auch für die biotechnologischen Produktionsprozesse. Die Bioreaktionstechnik
behandelt jedoch nur die Umsetzung der Edukte mit Biokatalysatoren in Produkte. Die Umsetzung
muß genau verfolgt werden, um hohe Produktivität und Produktqualität zu erreichen. Die Bedeu
tung der Off-line-und On-line-Überwachung der Konzentration der Biokatalysatoren (Mikroorga
nismen und Zellen) und der Zusammensetzung der Kultivierungsmedien hat in den Forschungs
laboratorien in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Wegen der GMP (Good Manufac
turing Praxis), die eine gen aue Dokumentation des Produktionsprozesses verlangt, nimmt ihre
Bedeutung in der Industrie ebenfalls zu.
Das Fehlen geeigneter Instrumente mit der erforderlichen Spezifität und Empfindlichkeit für die
Prozeßüberwachung und -regelung ist ein besonderes Problem für die biotechnologischen Produk
tionsprozesse, für die häufig komplexe Medien aus landwirtschaftlichen Neben-/Abfallprodukten
mit zahlreichen schlecht definierten Komponenten verwendet werden. Der Betrieb der Bioreaktoren
verlangt häufige Naßdampfsterilisationen, die die Nutzung von In-situ-Instrumenten stark einengt.
Die wenigen In-situ-Techniken werden beeinträchtigt durch die Signaldrift, die durch die Naß
dampfsterilisation und die Ablagerungen in den Membranporen (pH, p02) bedingt ist, sowie durch
die Änderung der Lichtdurchlässigkeit der Lichtquellen-und Detektorfenster (OD, Turbidität). Kul
turfluoreszenz kann durch zahlreiche Fluorophore, die in komplexen Medien vorliegen, beeinflußt
werden. Aus diesem Grunde werden die meisten physikalisch-chemischen Analysen außerhalb des
Reaktors durchgeführt, die aus der sterilen Probeentnahme, der Probeaufbereitung, der physika
lisch-chemischen Analyse selbst und der Signalauswertung bestehen. Jeder dieser Prozesse kann
eine Quelle fehlerhafter Ergebnisse sein. Daher ist ihre Kontrolle notwendig. Die Zeit für die
gesamte Analyse muß kurz genug sein, um sie zur Prozeßkontrolle zu nutzen.
Die On-line-Fließinjektionsanalyse und die massenspektrometische In-line-Analyse gasförmiger
und flüchtiger Komponenten lassen sich für solche Messungen einsetzen. Häufige Kalibration und
Kontrolle durch andere Instrumente sind notwendig. On-line-HPLC oder GC eignen sich gut für
solche Kontrollmessungen.
Diesen Anforderungen entsprechend werden moderne Bioreaktoren mit folgenden Geräten,
Einrichtunsen und Instrumenten ausgestattet (Abb. 1.1):
- Naßdampfversorgung und Sterilfilter für den aseptischen Betrieb
- Thermometer für die Temperaturüberwachung und -kontrolle
- Geräte für die Drucküberwachung und -kontrolle
- Geräte für die Messung und Kontrolle des Flüssigkeitsniveaus
Waage für die Kontrolle des Reaktorgewichtes
- Einrichtungen für die Füllung und das Ablassen sowie für die Off-line-Probeentahme des
Mediums
- Strömungsmeßgeräte für die Flüssigkeits-und Gasdurchsätze
Geräte für die Rührerdrehzahlkontrolle
Wattmeter für die Überwachung des Leistungseintrags
pH-Meter und Einrichtung zur SäurelLauge-Dosierung für die pH-Kontrolle