Biochemische, biophysikalische und histologische Analysen der Aktin-Nukleationsfaktoren FHOD1 ...

154 Pages·2011·31.33 MB·German

by  Stopschinski, Barbara Elena

Aus dem Institut für Physiologische Chemie
Abteilung Biochemie supramolekularer Systeme
der Ruhr-Universität Bochum
ehem. Direktor: Prof. Dr. rer. nat. Roger S. Goody

Biochemische, biophysikalische und histologische Analysen
der Aktin-Nukleationsfaktoren FHOD1 und ForC

Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von
Barbara Elena Stopschinski
aus Essen
2010
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. rer. nat. R. S. Goody
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. K. Jaquet

Tag der Mündlichen Prüfung: 17. Mai 2011
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG.................................................................................................11
1.1 Das Aktinzytoskelett..............................................................................................11
1.1.1 G-Aktin, F-Aktin und die Aktin-Tretmühle......................................................11
1.1.2 Zelluläre Aktinfunktionen..................................................................................15
1.1.3 Aktin-regulierende Proteine...............................................................................15
1.1.4 Aktinnukleation.................................................................................................18
1.2 Formine...................................................................................................................22
1.2.1 Einteilung...........................................................................................................22
1.2.2 Domänenorganisation und molekulare Funktion...............................................23
1.2.3 Aktivierung und Regulation...............................................................................29
1.2.4 Zelluläre Funktionen..........................................................................................30
1.2.5 FHOD1...............................................................................................................32
1.2.6 Formine in Dictyostelium discoideum...............................................................34
1.2.7 Mit Forminen assoziierte Erkrankungen............................................................36
1.3 Kleine GTPasen und Signaltransduktionswege des Aktinzytoskeletts.............38
2 MATERIALIEN UND METHODEN................................................................43
2.1 Materialien.............................................................................................................43
2.1.1 Verbrauchsmaterialien.......................................................................................43
2.1.2 Chromatographiesäulen.....................................................................................44
2.1.3 Reagenziensätze.................................................................................................44
2.1.4 DNA-Konstrukte................................................................................................44
2.1.5 Enzyme, Antikörper und Proteinstandards........................................................45
2.1.6 Geräte.................................................................................................................46
2.1.7 Zellen.................................................................................................................47
2.1.8 Lösungen und Puffer..........................................................................................47
2.2 Molekularbiologische Methoden..........................................................................54
2.2.1 PCR....................................................................................................................54
2.2.2 Gerichtete Mutagenese......................................................................................55
2.2.3 Gensynthese.......................................................................................................55
2.2.4 Agarosegelelektrophorese..................................................................................56
2.2.5 Restriktionsverdau.............................................................................................57
2.2.6 Ligation..............................................................................................................57
2.2.7 Transformation von Bakterien...........................................................................58
2.2.8 Amplifikaton und Isolierung der Plasmid-DNA................................................58
2.2.9 DNA-Sequenzierung..........................................................................................59
2.2.10 Glyceroldauerkulturen.......................................................................................60
2.3 Proteinbiochemische Methoden............................................................................60
2.3.1 Proteinexpression und Zellernte........................................................................60
2.3.2 Zellaufschluss....................................................................................................61
2.3.3 Affinitätschromatographie.................................................................................61
2.3.4 TEV-Protease-Verdau der Proteine...................................................................62
2.3.5 Präparative Größenausschlusschromatographie................................................63
2.3.6 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)..........63
2.3.7 Bestimmung der Proteinkonzentration..............................................................64
2.3.8 Konzentrierung der Proteine..............................................................................65
2.3.9 Enzymatische Modifikation von Proteinen........................................................65
3
2.3.10 Immundetektion von Proteinen (Pip-Strip, Western Blot, Dot Blot)................65
2.3.11 Reinigung des polyklonalen anti-FHOD1-Antikörpers.....................................68
2.4 Zellbiologische Methoden......................................................................................69
2.4.1 Zellkulturen und Transfektion der Zellen..........................................................69
2.4.2 Zellernte.............................................................................................................69
2.5 Histologische Methoden........................................................................................70
2.5.1 Organentnahme und Fixierung..........................................................................70
2.5.2 Paraffineinbettung und Herstellung von Paraffinschnitten................................70
2.5.3 Entparaffinierung der Gewebeschnitte..............................................................70
2.5.4 Histologische Übersichtsfärbungen mit Hämatoxylin und Eosin......................71
2.5.5 Epitopfreilegung................................................................................................71
2.5.6 Immunhistochemische Färbungen.....................................................................72
2.5.7 Auswertung der histologischen Präparate..........................................................75
2.6 Biophysikalische Methoden..................................................................................75
2.6.1 Analytische Größenausschlusschromatographie...............................................75
2.6.2 Isotherme Titrationskalorimetrie.......................................................................76
2.6.3 Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS).................................77
2.6.4 Kristallisation.....................................................................................................77
2.6.5 NMR-Spektroskopie..........................................................................................78
3 ERGEBNISSE...............................................................................................82
3.1 Synthese der ForC cDNA......................................................................................82
3.2 Klonierung, Expression und Reinigung der Proteine.........................................84
3.3 Farnesylierung von Rac1.......................................................................................89
3.4 Untersuchungen der Interaktion von ForC und FHOD1 mit Rac1..................94
3.5 Untersuchungen der Lipidbindung von FHOD1..............................................100
3.6 NMR-Spektroskopie der ForC-GBD.................................................................104
3.7 Reinigung und Charakterisierung des FHOD1-Antikörpers..........................106
3.8 Darstellung der FHOD1-Expression in der Mausmilz.....................................108
4 DISKUSSION...............................................................................................112
4.1 Analyse der Interaktion von ForC und FHOD1 mit Rac1...............................112
4.2 Analyse der Lipidbindungen von FHOD1.........................................................114
4.3 Struktur der ForC-GBD.....................................................................................116
4.4 Expression von FHOD1 in proliferierenden B-Lymphozyten der Milz.........123
5 ZUSAMMENFASSUNG...............................................................................127
6 LITERATURVERZEICHNIS.........................................................................130
7 DANKSAGUNG
8 CURRICULUM VITAE
4
Abkürzungen
A Amper
Å Ångström (10-10 m)
ABD Aktin-bindende Domäne
ABP Aktin-bindendes Protein
ADF Aktin-Depolymerisationsfaktor
ADP Adenosindiphosphat
Amp Ampicillin
AP alkalische Phosphatase
APC adenomatöse Polyposis coli
APS Ammoniumperoxodisulfat
ATP Adenosintriphosphat
Arf Adenosinphosphat-Ribosylierungsfaktor
Arp Aktin-verwandtes Protein, actin related protein
ARPC Arp-Komplex, actin related protein complex

B Magnetfeldstärke
0
Bni an der Knospungseinschnürung beteiligtes Protein,
bud neck involved protein
Bnr mit der Knospungseinschnürung verwandtes Protein,
bud neck related protein
BSA bovines Serumalbumin

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat, cyclic adenosine monophosphate
CC coiled-coil
CD Differenzierungscluster, cluster of differentiation
Cdc42 Zellteilungskontrollprotein 42 Homolog,
cell division control protein 42 homologue
cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat, cyclic guanosine monophosphate
CLL chronisch lymphatische Leukämie
Cob Cordon-bleu
C-Terminus Carboxyterminus der Proteinprimärsequenz

Da Dalton
DAAM dishevelled-associated activator of morphogenesis
DAD Diaphanous-autoregulatorische Domäne
DD Dimerisierungs-Domäne
ddH O doppelt destilliertes Wasser
2
dDia Dictyostelium discoideum Diaphanous
(d)dNTP (Di)desoxynukleotidtriphosphat
dH O destilliertes Wasser
2
DID Diaphanous-inhibitorische Domäne
DNA Desoxyribonukleinsäure
DRF Diaphanous-verwandtes Formin, diaphanous-related formin
DTE Dithioerythritol

EBV Epstein-Barr-Virus
ECL erweiterte Chemilumineszenz, enhanced chemiluminescence
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
5
ELISA indirekter enzymgekoppelter Immunadsorptionstest,
enzyme linked immunosorbent assay
ERK-MAP durch extrazelluäre Signale regulierte Kinase mitogen aktiviertes Protein
ESI-MS Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

F Farad
FAK Fokale Adhäsionskinase
F-Aktin fibrilläres Aktin
F kristallisierbares Fragment, crystallizable fragment
c
FERM Band 4.1 (four-point-one)/Ezrin-Radixin-Moesin
FH Forminhomologiedomäne
FHOD FH2-enthaltendes Protein, FH2-containing protein
FHOS Forminhomolog überexprimiert in der Milz,
formin homologue overexpressed in spleen
FID freier Induktionszerfall, free induction decay
fl Volllängenprotein, full length protein
FMN Formin
FMNL Formin-ähnliches Protein, formin-like protein
ForC Formin C
FPLC schnelle Protein-Flüssigchromatographie,
fast protein liquid chromatography

g je nach Kontext Erdbeschleunigung oder Gramm (Massenbezeichnung)
γ gyromagnetisches Verhältnis
G-Aktin globuläres Aktin
GAP GTPase-aktivierendes Protein
GBD GTPase-bindende Domäne
GDI GDP-Dissoziations-Inhibitor
GDF GDI-Dissoziationsfaktor
GDP Guanosindiphosphat
GEF Guaninnukleotid-Austauschfaktor, guanin nucleotide exchange factor
GLUT Glukose-Transporter
GMP Guanosinmonophosphat
GNBP Guaninnukleotid-bindendes Protein
GSH Glutathion
GST Glutathion-S-Transferase
GTP Guanosintriphosphat

h Stunde
HA Hämagglutinin
hDia humanes Diaphanous
HE Hämatoxylin-Eosin
HeLa Zervixkarzinomzellen der Patientin Henrietta Lacks
HPLC Hochleistung-Flüssigchromatographie,
high performance liquid chromatography
HRP Meerrettichperoxidase, horse radish peroxidase
Hsc Hitzeschockprotein, heat shock cognate protein
HSQC heteronukleare Einquantenkohärenz,
heteronuclear singel quantum coherence

INF Invertiertes Formin
IPTG Isopropyl-1-Thio-D-Galactopyranosid
6
IRAP Insulin-responsive Aminopeptidase
IRS Insulinrezeptor-Tyrosinkinase Substrat
ITC isotherme Titrationskalorimetrie, isothermal titration calorimetry

kb Kilobasen
kcal Kilokalorien
kDa Kilodalton

J Kernspin
JAK Janus-Kinase

l Liter
LB Luria Bertani
LC/MS flüssige Chromatographie/Massenspektrometrie,
liquid chromatography/mass spectrometry
ld Extremitätenfehlbildung, limb deformity
LIMK Lin11, Isl-1, Mec-3-Domäne-Kinase
Lmod Leiomodin
LMW low molecular weight marker

M Molar
M Gesamtmagnetisierung
0
µ magnetisches Moment
MAL Megakaryozyten-akute-Leukämie-Faktor
mDia Diaphanous der Säugetiere, mammalian diaphanous
MHz Megaherz
min Minute
MLC(K) Myosin-leichte-Ketten(-Kinase), myosin light chain kinase
MW Molekulargewicht
MWCO Ausschlussgröße, molecular weight cut-off

NMR Kernspinresonanz, nuclear magnetic resonance
NOESY Spektroskopie mit Nuclear-Overhauser-Effekt und Austausch,
nuclear overhauser and exchange specroscopy
NPF Nukleations-fördernder Faktor, nucleation promoting factor
NTA Nickelnitrilotriessigsäure
N-Terminus Aminoterminus der Proteinprimärsequenz
N-WASP neuronales Wiskott-Aldrich Syndrom Protein

ω Larmorfrequenz
0
OD optische Dichte bei einer Lichtwellenlänge von 600nm
600

Pi organisches Phosphat
PAK p21-aktivierte Kinase
PALS periarterielle lymphatische Scheide
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung, phosphate buffered saline
PBS-T PBS mit Tween-20
PCR Polymerasekettenreaktion, polymerase chain reaction
PDB Proteindatenbank
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
PIP Phosphatidylinositolphosphat
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphophat
7
PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat
PIP5-Kinase Phosphatidylinositol-4-Phosphat-5-Kinase
PIC Protease-Inhibitor-Cocktail
ppm parts per million
PVDF Polyvinylidenfluorid

Rac Ras-verwandtes C3-Botulinumtoxinsubstrat
RAD Ras-Assoziations-Domäne
RalGDS Ral-Guaninnukleotid-Dissoziations-Stimulator
Ran nukleäres Ras-Protein, Ras-related nuclear protein
Ras Rattensarkom
RBD Ras-bindende Domäne
REP Rab-Eskortprotein
Rho Ras-Homologie
rms Abweichung der Wurzel des mittleren Abstandquadrats,
root mean square deviation
ROCK Rho-assoziierte coiled-coil-Kinase

SCID schweres kombiniertes Immundefizienz-Syndrom,
severe combined immunodeficiency syndrome
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
sek Sekunde
SH Src-Homologiedomäne
Src Steroidrezeptor-Koaktivator, steroid receptor coactivator
SRE Serum-responsives Element
SRF Serum-responsiver Faktor
STAT Signaltransduktoren und Transkriptionsaktivatoren,
signal transducers and activators of transcription

T longitudinale Relaxationszeit
1
T transversale Relaxationszeit
2
T Halbwertszeit
1/2
TBE Tris-Borat-EDTA
TBS Tris-gepufferte Salzlösung, Tris-buffered saline
TCEP Tris-2-Carboxyethyl-Phosphinhydrochlorid
TE Tris-EDTA
TEMED Tetramethylethylendiamin
TEV Tobacco-Etch-Virus
TMR Tetramethylrodamin
Toca-1 Cdc42-abhängiges, Aktin-assemblierendensVermittlerprotein,
transducer of Cdc42-dependant actin assembly-1
TOCSY vollständige Korrelationsspektroskopie, total correlation spectroscopy

U Unit, Enzymeinheit (1 Unit ist definiert als die Menge an Enzym, die nötig
ist, um 1 µmol Substrat pro Minute umzusetzen)

VASP Vasodilator-stimulierendes Phosphoprotein
v/v Volumen pro Volumen

WASH WASP-Familie-Homologieprotein
WASP Wiskott-Aldrich Syndrom Protein
8
WAVE WASP-Familie-Verprolin-Homologieprotein
WBR Western Blocking Reagent
WCA Domäne bestehend aus einer WH2-Domäne sowie einer zentralen (central)
und sauren (acidic) Region
WH WASP-Homologiedomäne
WHAMM WASP-Homologieprotein assoziiert mit Aktin, Membranen und
Mikrotubuli
WHIF WH2-enthaltendes Formin, WH2-containing formin
WIP WASP-interagierendes Protein
WISH-B WASP-interagierendes SH3-Domäne-enthaltendes Protein B
w/v Gewicht pro Volumen, weight per volume
Tabellen
Tabelle 1.1 Auflistung einer Auswahl wichtiger Capping-Proteine......................17
Tabelle 1.2 Beispiele wichtiger quervernetzender Proteine..................................18
Tabelle 1.3 Ausgewählte Effektorproteine der Rho-GTPasen...............................42
Tabelle 2.1 Zyklusparameter eines typischen PCR-Ansatzes................................54
Tabelle 2.2 Typisches PCR-Pipettierschema.........................................................55
Tabelle 2.3 PCR-Pipettierschema für die megaprimer-Methode..........................55
Tabelle 2.4 PCR-Ansätze für die Gensynthese......................................................56
Tabelle 2.5 PCR-Zyklusparameter für die Gensynthese........................................56
Tabelle 2.6 Pipettierschema für den Restriktionsverdau.......................................57
Tabelle 2.7 Pipettierschema für den Ligationsansatz............................................58
Tabelle 2.8 Reaktionsansatz für die DNA-Sequenzierung.....................................59
Tabelle 2.9 Zyklusparameter der Sequenzierungs-PCR........................................60
Tabelle 2.10 Rezepturen für die Herstellung von Trenn- und Sammelgelen...........64
Tabelle 2.11 Auflistung der Primärantikörper........................................................73
Tabelle 2.12 Auflistung der Sekundärantikörper (alle polyklonal).........................74
Tabelle 3.1 Übersicht der verwendeten rekombinanten Proteine.........................85
Tabelle 3.2 Molekulargewichte der Rac1-Konstrukte...........................................92
Abbildungen
Abbildung 1.1 Räumliche Struktur von ATP-G-Aktin................................................12
Abbildung 1.2 Modell der F-Aktin-Struktur...............................................................13
Abbildung 1.3 ATP-Hydrolyse und Aktinpolymerisation...........................................14
Abbildung 1.4 Schematische Darstellung eines verzweigten Aktinfilaments.............19
Abbildung 1.5 WASP-Domänenorganisation und –aktivierung.................................20
Abbildung 1.6 DRF-Domänenorgansiation und Aktivierungsprinzip........................23
Abbildung 1.7 Bändermodell der dimeren Bnp1p-FH2-Domäne..............................24
Abbildung 1.8 Treppen-Modell der Aktin-Polymerisation durch Formine................26
Abbildung 1.9 Domänenorganisation von FHOD1 im Vergleich zu mDia1..............32
Abbildung 1.10 Bändermodell des FHOD1-N-Terminus.............................................33
Abbildung 1.11 Elektronenmikroskopische Aufnahme des Dictyostelium-Zyklus. ......35
Abbildung 1.12 Schematische Darstellung des GTPase-Zyklus...................................39
Abbildung 1.13 Struktur und Funktion der G-Domäne................................................40
Abbildung 1.14 Fluoreszenzaufnahmen von Swiss 3T3 Fibroblasten..........................42
Abbildung 3.1 Sequenzvergleich des N-Terminus von ForC und FHOD1................82
Abbildung 3.2 Darstellung der codonoptimierten DNA-Sequenz der ForC-GBD.....83
9
Abbildung 3.3 Darstellung der ForC-GBD Gensynthese...........................................84
Abbildung 3.4 Schematische Darstellung der ForC-Konstrukte................................86
Abbildung 3.5 Darstellung der ForC-GBD aus E. coli..............................................86
Abbildung 3.6 Schematische Darstellung der FHOD1-Konstrukte...........................87
Abbildung 3.7 Darstellung des Reinheitsgrades von His-FHOD1-N........................88
Abbildung 3.8 Darstellung des Reinheitsgrades der Rac1-Konstrukte......................89
Abbildung 3.9 Darstellung der Rac1-Konstrukte.......................................................91
Abbildung 3.10 ESI-Spektren von Rac1-CALM...........................................................93
Abbildung 3.11 Analytische Größenausschlusschromatographie................................95
Abbildung 3.12 Titration von GST-Rac1-G12V-CALM zur ForC-GBD......................97
Abbildung 3.13 Titration von GST-Rac1-G12V-CALM in His-FHOD1-N..................98
Abbildung 3.14 Tiration der ForC-GBD in GST-Rac1-G12V-CALM.........................99
Abbildung 3.15 Pip-Strip mit His-Profilin.................................................................101
Abbildung 3.16 Pip-Strips mit Profilin und His-FHOD1-fl.......................................101
Abbildung 3.17 Pip-Strip mit His-FHOD1-N.............................................................102
Abbildung 3.18 Pip-Strips mit phosphoryliertem His-FHOD1-fl..............................103
Abbildung 3.19 TOCSY- und NOESY-Spektren der ForC-GBD................................105
Abbildung 3.20 HSQC-Spektrum der ForC-GBD......................................................106
Abbildung 3.21 Dot Blot mit dem anti-FHOD1-Antikörper.......................................107
Abbildung 3.22 Western Blot mit dem anti-FHOD1-Antikörper................................107
Abbildung 3.23 Immunhistochemische Färbungen eines Lymphfollikels der Milz....110
Abbildung 3.24 Immunfluoreszenz-Färbungen eines Lymphfollikels der Milz..........111
Abbildung 4.1 Struktur der ForC-GBD im Vergleich zur FHOD1-GBD................119

10