BIOACTIVITY OF PLANTS SECONDARY METABOLITES Estrogenic, cytotoxic and anabolic effects ...

169 Pages·2013·3.71 MB·English

BIOACTIVITY OF PLANTS SECONDARY METABOLITES
Estrogenic, cytotoxic and anabolic effects on estrogen
target organs of an extract of Erythrina excelsa and
Ecdysterone

A thesis presented to:

The Institute of Cardiovascular Research and Sports Medicine
Department of Molecular and Cellular Sports Medicine
German Sport University Cologne

In partial fulfillment of the requirements for the degree

PhD in Natural Sciences
by:
Sadrine Tchoukouegno Ngueu
From Bamenyam, Cameroon
Members of the jury:

- Prof. Dr. Patrick Diel (First referee)
- Prof. Dr. Günter Vollmer (Second referee)
- Prof. Dr. Wilhelm Schänzer
- Dr. Frank Hülsemann

Date of defence: 05.09.2013
Gedruckt mit Unterstützung des Deutschen Akademischen Austauschdienstes
(DAAD)
Versicherung gem. § 7 Abs. 2 Nr. 4

Hierdurch versichere ich:
Ich habe diese Arbeit selbständig und nur unter Benutzung der angegebenen
Quellen und technischen Hilfen angefertigt; sie hat noch keiner anderen Stelle zur
Prüfung vorgelegen. Wörtlich übernommene Textstellen, auch Einzelsätze oder Teile
davon, sind als Zitate kenntlich gemacht worden.

……………………………………
Sadrine Tchoukouegno Ngueu

Erklärung gem. § 7 Abs. 2 Nr. 5

Hierdurch erkläre ich, dass ich die Leitlinien guter wissenschaftlicher Praxis der
DeutschenSporthochschule Köln in der aktuellen Fassung eingehalten habe.

……………………………………
Sadrine Tchoukouegno Ngueu
I dedicate this work to:

 God almighty and to Jesus Christ my Lord and
Savior in whom I trust.

 My lovely husband Olivier Ndiapi for his
endless support through happy and difficult
times. These 4 years away from each other
were challenging but your support was always
an encouragement to me.
Acknowledgements

Acknowledgements

I would not have completed this work without the help and support of several
persons. Foremost, special thanks go to my supervisor Prof.Dr. Patrick Diel who did
not only give me his support throughout the completion of my thesis work, but also
supported me with the DAAD scholarship application procedure. I extend my thanks
to Prof. Guenter Vollmer for his helpful pieces of advice regarding my work and who,
during these years, wrote letters of recommandation that helped extend my
scholarship. I am also grateful to Prof. Dr. Maria Paar who guided me through my first
chromatographic separation.
I thank the German academic service exchange (DAAD) for granting me the
scholarship.
I had the opportunity to work in a team composed of persons from different
horizons and experiences which was very helpful not only for my academic
advancement, but also contributed to build certain traits of my character. I think of my
colleagues Jonas Hengevoß, Xiao Juan Hu, Sephanie Mosler, Felix Kluxen, Nora
Zoth, Almut Molzberger, Carmen Weigt, Tina Blei, Dennis Mueller, and Martina
Velders. I specially thank Felix Kluxen not only for the helpful tips in the lab, but also
for his availability and patience towards me during my first days in Germany.
My gratitude also goes to our technical assistant crew composed of Anika
Voß, Ute Laudenbach-Leschowski, Ghilav Mojgan, and Bianca Collins who were
always available to assist me in the pratical aspects of laboratory work. Special
thanks go to Ute Laudenbach for her support in all aspects of animal experiments.
I would also like to acknowledge the support of my former Master degree
supervisor, Prof. Njamen Dieudonne, during my scholarship application process and
during my PhD thesis work.
M.Sc. Sadrine Tchoukouegno Ngueu vi
Acknowledgements

Special thanks to Maria Halabalaki (School of pharmacy, University of Athens)
for her support in my work and for granting me the opportunity to carry out an
internship in the pharmacognosy laboratory of the University of Athens.
I will not forget Job Tchoumtchoua who has been more than a friend to me.
Thank you for the long discussions over the phone and for introducing and
supervising me in your lab in Athens.
I thank Raoul Kempkes of the Biochemistry department for his technical
support in the use of the flow cytometer.
Finally, I thank my family for their continuous support in the course of my
education. I think also of my late parents and my late elder brother who took me as
he his own child and guided me throughout my studies.

M.Sc. Sadrine Tchoukouegno Ngueu vii
Zusammenfassung

Zusammenfassung

Heilpflanzen dienen als primäre Gesundheitsversorgung in den meisten
asiatischen und afrikanischen Ländern. In westlich geprägten Ländern in denen
hauptsächlich auf naturwissenschaftlichen Grundsätzen basierende Medizin
praktiziert wird, werden Stoffe aus pflanzlicher Herkunft entweder direkt als
Kräuterformulierungen oder als Ergänzung zu bestehenden Therapien verwendet.
Daneben können Pflanzen mit aktiven Wirkstoffen auch Teil der Ernährung sein. Es
besteht die allgemeine Überzeugung, dass pflanzliche Heilmittel aufgrund ihres
natürlichen Ursprungs sicher sind. Daher werden sie oft im Rahmen
selbsttherapeutischer Maßnahmen verwendet und sind in Deutschland auch nicht
rezeptpflichtig. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Bioaktivität, Wirkungen aber auch
potentiellen Nebenwirkungen derartiger pflanzlicher Heilmittel. Hierbei stehen
Extrakte aus Erythrina excelsa sowie die Substanz Ecdysterone im Mittelpunkt des
Interesses. Erythrina excelsa ist eine Pflanze die in der kamerunischen traditionellen
Medizin zur Behandlung von Wechseljahrsbeschwerden und gynäkologische
Tumoren Anwendung findet. Ob Erythrina excelsa allerdings wirklich
pharmakologisch aktive Substanzen enthält, die derartige Wirkungen erzielen
können, wurde bisher noch nicht untersucht. Ecdysterone (Ecdy) ist ein Inhaltsstoff
von verschiedenen Pflanzen, die in der chinesischen, ayurvedischen und russischen
traditionellen Medizin zur Behandlung unterschiedlichster Beschwerden verwendet
werden. Für Ecdy konnte eine anabole Wirkung in vitro und in vivo gezeigt werden.
Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht aufgeklärt sind, wird es
intensiv als Nahrungsergänzungsmittel zur Steigerung des Muskelaufbaus beworben
und auch von Bodybuildern verwendet. Ein Missbrauch zum Doping in anderen
Sportarten wird befürchtet. Die Ziele dieser Arbeit waren zum einen die Bioaktivität
von Extrakten von Erythrina excelsa, die in Bezug zur traditionellen Anwendung in
der Naturmedizin stehen, sowie die biologisch aktiven Inhaltsstoffe in den Extrakten
näher zu charakterisieren. Zum anderen sollten die Mechanismen der anabolen
Wirkung von Ecdysterone untersucht werden.
M.Sc. Sadrine Tchoukouegno Ngueu viii
Zusammenfassung
Mittels Yeast Estrogen Screen (YES), uterotrophen Assay und des MTT-Assay
konnte gezeigt werden, dass ein Äthanolextrakt von E. excelsa östrogene/anti-
östrogene und zytotoxische Effekte aufweist. Eine dreitägige subkutane
Verabreichung des Extraktes in einer Dosis von 50 mg/kg KG/Tag an
ovariektomierten Wistar Ratten führte zu signifikanten östrogenen Wirkungen auf
morphometrische Parameter der Gebärmutter (Feuchtgewicht und epithelialen
Höhen) und auf die Expression von Östrogen-abhängigen Genen in der Gebärmutter
(C3 und Clusterin) und in der Leber (CaBP9K und IGFBP-1). Bei einer Dosis von 100
mg/kg KG/Tag zeigte der Extrakt unerwartet auf die beschriebenen biologischen
Endpunkte eine anti-östrogene Wirkung. Eine fünftägige Behandlung von
Estrogenrezeptor (ER) -positiven MCF-7 Brustkrebszellen mit dem Extrakt führte zu
einem biphasischen Profil: Bei niedrigen Konzentrationen kam es zu einem leichten
Anstieg der Zellviabilität, bei höheren Konzentrationen dagegen zu einer Induktion
von Zelltod. Dagegen wurde bei der Behandlung von ER negativen HT-29 Zellen
Zytotoxizität bei allen getesteten Konzentrationen beobachtet. Um die Wirkstoffe des
Extraktes näher zu charakterisieren, wurde eine Vakuum Flüssigchromatographie
Fraktionierung durchgeführt. Biologisch aktive Fraktionen wurden mittels des YES
Assays identifiziert und die biologische Wirkung dieser Fraktion auf Proliferation und
Apotose von MCF-7-Brustkrebs-Zellen mittels Durchflusszytometrie,
Genexpressionsanalyse und Immunhistochemie untersucht. Die Dichloromethan-
Methanol (50:50 v/v) Fraktion (F4), die in Bezug auf östrogene und zytotoxische
Wirkung die aktivste Fraktion war, zeigte eine nicht-monotone Konzentrations-
Wirkungs-Kurve auf den Zellzyklus, die Proliferation und Apoptose von MCF-7
Brustkrebszellen. Bei niedrigen Konzentrationen und in Abwesenheit von E2, förderte
F4 Östrogenrezenptor- abhängig die Proliferation von MCF-7 Zellen (Hochregulation
von Cyclin D1 und Herunterregulation des Bax/Bcl-2-mRNA Verhältnisses).
Interessanterweise wirkte F4 in den gleichen Konzentrationen bei Anwesenheit von
E2, als Antagonist und verhinderte ein E2-induziertes Zellwachstum. Bei höheren
Konzentrationen modulierte F4 den Zellzyklus zugunsten einer gesteigerten
Apoptose (Erhöhung des Caspase-gespaltenen Zytokeratin 18, Hochregulation des
Bax/Bcl-2 Verhältnisses und Herunterregulation von Cyclin-D1-mRNA). In
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Halabalaki von der Abteilung für
Pharmakognosie und Naturstoffchemie der Universität von Athen wurde eine weitere
M.Sc. Sadrine Tchoukouegno Ngueu ix
Zusammenfassung
Charakterisierung des Extraktes mittels LC-HRMS und LC-HRMS/MS Analyse
durchgeführt um die im Extrakt enthaltenen Isoflavonoide zu identifizieren. Diese
Analyse zeigte, dass Pyran- und Prenyl-Isoflavonoidderivate die charakteristischen
chemischen Stoffe des Extrakts sind was auch die beobachtete Kombination der
biologischen Eigenschaften des Extraktes erklären könnte.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die anabolen Wirkmechanismen von
Ecdysterone, Erythrina excelsa Extrakt und Genistein in differenzierten C2C12
Myoblasten, einem Zellkulturmodell für Skelettmuskelhypertrophie untersucht. Als
untersuchter biologischer Endpunkt diente die Zunahme des Durchmessers von
C2C12 Myotuben. Für die nähere Charakterisierung der involvierten molekularen
Mechanismen wurden Studien mit Vergleichssubstanzen wie
Androgenrezeptoragonisten (DHT), Androgenrezeptorantagonisten (Flutamid),
anabol wirkende Peptidhormone (IGF-1) und verschiedene Östrogenrezeptor
bindende Substanzen mit agonistischen (E2), antagonistischen sowie ER alpha und
ER beta selektiven Bindungseigenschaften verwendet. Mit diesem Modell konnten
die wachstumsfördernden Wirkungen von IGF1, DHT, E2, Ecdy und des
Phytoestrogens Genistein auf die Skelettmuskulatur bestätigt werden. Co-
Behandlung von Myotuben mit Ecdy und ZK führte zu einer Hemmung der Ecdy-
induzierten Hypertrophie. Darüber hinaus führte auch eine Co-Behandlung von
Myotuben mit E2 oder Ecdy und dem selektiven ER beta Antagonisten zu einer
Antagonisierung der hypertrophen Wirkung von beiden Substanzen, was ein Zeichen
von ERβ-abhängigem Effekt ist.
Zusammenfassend zeigen die Befunde dieser Arbeit einerseits, dass der
Extrakt von Erythrina excelsa biologische Effekte aufweist, die in engem
Zusammenhang zu seiner traditionellen Verwendung stehen. Sie weisen auch darauf
hin, dass diese Pflanze eine Quelle pharmakologisch aktiver Stoffe ist, die von
potentiellem Interesse für weitere Untersuchungen sind. Darüber hinaus zeigen die
Ergebnisse dieser Arbeit, dass Stoffe mit ER beta Bindungseigenschaften das
Skelettmuskelwachstum fördern. Diese Erkenntnis ist von Interesse für die
Behandlung von atropischen Erkrankungen des Skelettmuskels wie z. B der
altersbedingten Abnahme der Muskelmasse (Sarkopenie). Allerdings kann dieser
M.Sc. Sadrine Tchoukouegno Ngueu x