Bio-Monitoring von Aquatischen Ökosystemen Biomonitoring of aquatic ecosystems

174 Pages·2010·1.19 MB·English

Bio-Monitoring von Aquatischen
Ökosystemen

Biomonitoring of aquatic ecosystems

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Hoda Abd El Aziz Mohamed Ahmed
aus Alexandria (Ägypten)
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 24.09.2010

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Dr. h. c. Donat-Peter Häder
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Ralf Anken

II
Dedication
To my late father
To my lovely mother
Hoda

III
Acknowledgements

I’m greatly indebted to my supervisor, Prof. Dr. Dr. h. c. Donat-Peter Häder for his keen
supervision and valuable advice from the initial to the final development of this thesis.
His indispensable guidance and support was of great value to me.
I would like to express my deep and sincere gratitude for the financial and personal
support that I received from the German Academic Exchange service (Deutsche
Akademischer Austauch Dienst (DAAD) and the government of the Arab Republic of
Egypt for granting me such a valuable Ph.D. scholarship. I would like to thank the
Botany and Microbiology department, Faculty of Science and Alexandria University for
electing me for the Ph.D. scholarship.
I would like to thank Prof. Dr. Ralf Anken for being my second reviewer. I also wish to
express my appreciation to Dr. Peter Richter and Dr. Manfred Klisch for their advice
and helpful suggestions. This appreciation is also extended to cover all colleagues and
members at Chair of the Plant Ecophysiology.
I would like to convey my gratitude to my best friends Friedrike shöck, Isabelle
Zagaroski, and Katharine Zagaroski for their continuous assistance in many aspects.
Special hearty appreciation is due to my mother, my sisters; especially Ebtesam, my
brothers and my husband Adel Hassan who have been supporting me with their
unreserved love, encouragement and continuous help.
Hoda

IV
Zusammenfassung

Die Steigerung anthropogener Tätigkeit, in Verbindung mit einer ständig wachsenden
Weltbevölkerung, hat in den letzten Jahrzehnten zu einer weitreichenden Beeinträchtigung
der Wasserqualität und zu Wasserverschmutzung geführt. Die Entwicklung von
Frühwarnsystemen, in Form von Bioassays, welche auf physiologischen Antworten von
Testorganismen gegenüber Schadstoffen beruhen, könnte wertvolle Werkzeuge für den
Schutz und das Management von Wasserökosystemen darstellen. Zusätzlich zu
chemischen und physischen Analysen ist Biomonitoring von Wasserökosystemen von
hoher Wichtigkeit. Wie in den letzten Jahren herausgefunden wurde, ist der einzellige
Süßwasser flagellate Euglena gracilis ein idealer Organismus, um
Wasserverschmutzungen festzustellen, bzw. um die Wasserqualität zu überwachen. Im
Rahmen intensiver Untersuchungen wurde festgestellt, dass dieser Organismus sehr
empfindliche physiologische Reaktionen gegenüber verschiedenen Schadstoffklassen
zeigt. Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es die Antworten verschiedener
physiologischer Parameter von E. gracilis gegenüber unterschiedlichen Schadstoffklassen
zu prüfen, um dabei zu ermitteln, ob ökologische Endpunkte (Bezugspunkte der
Wasserqualität beim Biomonitoring) mit diesem Organismus festgestellt werden können.
Neun Motilitäts- und Orientierungsparameter, mehrere photosynthetische Parameter, sowie
der Schadstoffeinfluss auf fünf photosynthetische Pigmente wurden experimentell als
Endpunkte gemessen.
Im ersten Teil der Studie wurden Bewegungsanalyse von E. gracilis als Antwort auf
Schwermetalle (Cu, Cd, Ni und Hg), Abwasserproben, Chlorine und Organische
Xenobiotische Schadstoffe (2,4-DCP und PCP) mit einem ECOTOX-System untersucht.
Dieses System ist ein automatisches Instrument, welches die Bewegungen von Organismen
in Abhängigkeit von Schadstoffen im Wasser analysiert. Die ECOTOX-Software beruht
auf einer Echtzeitbildanalyse des Bewegungsverhaltens von Organismen.
Bewegungsparameter (Beweglichkeit, Geschwindigkeit), Zellform und
Orientierungsparameter (nach oben schwimmender Zellen und Präzision der
gravitaktischen Orientierung), werden bestimmt. Der Bioassay wurde für kurze - und
langfristige Schadstoffexpositionszeiten im Intervall von drei Minuten bis zu sieben Tagen
durchgeführt. Die erhaltenen Messwerte wurden mit Sigmaplot, 2001 für Windows 2000
(SPSS Inc.) mathematisch weiter bearbeitet. Für viele Schadstoffe wurden
Wirkungskonzentrationskurven (Effect concentration, EC) ermittelt und die EC -Werte
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V
(d.h. 50-prozentiger Einfluss des Schadstoffes auf einen physiologischen Parameter)
bestimmt. Außerdem können andere ökotoxikologische Kenngrößen wie NOEC (no
observed effect concentration), Lethal dose (LD) und die niedrigsten Verdünnungsfaktor,
bei dem sich eine Hemmwirkung kleiner als ein festgelegter Grenzwert (G-Wert)
berechnet werden. Als Antwort auf die Schwermetalle Kadmium und Nickel verminderten
sich die EC Werte der Beweglichkeit von Euglena von 235 und 202 mg L-1 unmittelbar
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nach Exposition, zu 10 und 0.86 mg L-1 nach einer Inkubationszeiten von 24 Stunden. Bei
Kupferexposition von drei Minuten zeigten sich deutliche Änderungen in den
Beweglichkeits-Parameter der Algae. Die EC -Werte für die Hemmung der
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Beweglichkeit, die Präzision der Orientierung (r-Wert), die Geschwindigkeit und dem
Anteil nach oben schwimmender Zellen (repräsentiert negativ gravitaktische Orientierung)
betrugen 19, 20.4, 23 und 50 mg L-1. Im Gegensatz zu Nickel und Kadmium führte eine
längere Exposition von 24 Stunden gegenüber Kupferionen nicht zu einer ausgeprägten
Steigerung der Hemmung der Beweglichkeitsparameter. Nach einer Quecksilber
Kurzzeitaussetzung wurde der Parameter Beweglichkeit mit einem EC -Wert von 38 mg
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L-1 am empfindlichsten beeinträchtig. Der Anteil nach oben schwimmender Zellen war mit
einem EC -Wert von 59 mg L-1 am geringsten beeinträchtigt. Geschwindigkeit und r-Wert
50
zeigten gleiche Empfindlichkeit gegenüber Hg mit sehr ähnlichen EC -Werten von 50 und
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51 mg L-1. Bei längerer Expositionszeit zu Quecksilber (bis zu 24 Stunden) war die
Reihenfolge der Empfindlichkeit von r-Wert über Beweglichkeit, Geschwindigkeit zu
Aufwärtsschwimmen mit den EC -Werten 26 mg L-1, 35 mg L-1, 39 mg L-1 und 40 mg L-1.
50
Bei kurzfristiger Exposition wurde Euglena am stärksten durch Kupfer und in abfallender
Reihenfolge durch Quecksilber, Nickel und Kadmium beeinträchtigt. Bei 24-Stündiger
Exposition änderte sich die Reihenfolge der Schwermetallgiftigkeit: Cd > Ni > Cu > Hg.
Danach zeigte die weitere Verweildauer von 2 − 7 Tagen unbedeutende Änderungen in den
EC -Werten. Die Beweglichkeit, im Gegensatz zu anderen gemessenen
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Bewegungsparametern, wurde von den meisten der geprüften Schwermetalle bereits bei
einer niedrigeren Konzentrationen gehemmt. Das könnte auf eine Hemmung von
Proteinen, wie z.B. Calmodulin durch Schwermetalle zurückzuführen sein.
Die Überprüfung von Abwasserproben verschiedener Herkunft wurde mit dem ECOTOX-
Systemvorgenommen. In den meisten der getesteten Abwasserproben wird die Präzision
der Orientierung (r-Wert) bereits bei Konzentrationen gehemmt, die noch keine Wirkung
auf die anderen Bewegungsparameter zeigte. Es wurde festgestellt, dass Beweglichkeit und
Zellform die am wenigsten durch die Abwasserproben gehemmten wurden. Das könnte
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beispielsweise an die Wirkung auf Kalciumkanälen in der Zellmembran beruhen, welche
eine Rolle als Gravirezeptoren haben. Dieser Biotest ist auch in der Lage unterschiedlich
hohen Schadstoffgehalt in Wasserproben nachzuweisen, was z.B. für die Analyse der
Wasserqualität vor und nach einer Reinigungsstufe interessant ist. Darüber können
Aussagen über die Leistungsfähigkeit des Reinigungsschritts abgeschätzt werden.
Weiterhin könnte dieser Biotest auch dazu herangezogen werden die Belastungen in einem
Problemgebiet zu kartieren. Je nach Belastungsgrad treten mehr oder weniger starke
Effekte bei dem Testorganismus auf.
Chlorieren ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden für die Wasserdesinfektion,
die mehrere nachteilige Gesundheitseffekte einschließlich Krebs zur Folge hat. Bewegung
sowie Orientierungsrahmen in E. gracilis zeigte hohe Empfindlichkeit gegenüber Chlor.
Die Reihenfolgeder Empfindlichkeit war: Beweglichkeit > Geschwindigkeit > r-Wert >
Aufwärtsschwimmen mit EC -Werten 0.69, 0.81, 0.85 und 1.78 mg L-1. Diese EC -Werte
50 50
sind unterhalb der empfohlenen Konzentration für die Wasserdesinfektion (0.5 und 1 mg
L-1). Es besteht daher die dringende Notwendigkeit einer Entwicklung von sicheren und
rentablen alternativen Methoden für die Wasserbehandlung, welche die Verwendung von
gefährlichen Substanzen wie Chlor ersetzen kann.
Nach der direkten Exposition von Algen zu 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) waren EC -
50
Werte 205 und 125 mg L-1 für Beweglichkeit und Geschwindigkeit, sowie für die zwei
Orientierungsparameter r-Wert und Aufwärts-Schwimmen jeweils 200 mg L-1. Bei 24-
stündiger Inkubation wurden alle EC -Werte deutlich reduziert auf 18 und 23 mg L-1 für
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Beweglichkeit, Geschwindigkeit, 26 und 23 mg L-1 für Aufwärts-Schwimmen und r-Wert.
Die Beweglichkeit wurde bei der PCP Aussetzung mit EC -Werten von 27 und 17 mg L-1
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direkt danach und nach 24 Stunden Expostionszeit am stärksten gehemmt. Am wenigsten
wurde die Geschwindigkeit durch PCP gehemmt, mit einem EC -Wert von 63 mg L-1. Bei
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einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurde die Geschwindigkeit mit einem EC -Wert
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von 30 mg L-1 stärker gehemmt. Der Vergleich von EC -Werten stimmt sehr gut mit
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anderen standardisierten Bioassay überein. Das bedeutet, dass das ECOTOX-System in
Verbindung mit E. gracilis sowohl für Kurzzeittests als auch für längerfristige
Expositionstests einen aussagekräftigen Bioassay zur Kontrolle der Wasserqualität
darstellt. Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Inkubationszeit von 24 Stunden, für
einen Toxizitätstest für die meisten der geprüften Toxine, im Vergleich zu Tests mit
wenigen Minuten Inkubationszeit, als auch für längerer Inkubationen (sieben Tage) am
Besten geeignet war.
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Außerdem wurde untersucht, inwieweit Schwermetalle und Chlorophenol die
Photosynthese von E. gracilis beeinflussen. Mit einem PAM-Fluorimeter (pulse amplitude
modulated fluorimeter) wurden Chlorophyll-Fluoreszenz-Parameter gemessen, welche
direkt die Leistungsfähigkeit des Photosystems II (PSII) widerspiegeln. Schwermetalle
zeigten dabei nachteiligen Einfluss auf den photosynthetischen Wirkungsgrad sowohl für
Dunkelproben, als auch für an das Licht angepasste Proben, nach verschiedenen
Inkubationszeiten. Nickel-Konzentrationen 45, 90 oder 180 mg L-1 führten zu einer
bedeutende Verminderung des photosynthetischen Effizienz bis hin zum Nullwert nach
fünf Tagen Behandlungsdauer, bei vollständiger Hemmung von PSII. Ähnliche Effekte
wurden für an Licht angepasste Proben festgestellt. In diesem Fall fiel, in Gegenwart von
90 bzw. 180 mg L-1 Nickel, die photosynthetische Effizienz bereits innerhalb von zwei
Tagen auf Null. Nach Inkubationszeiten von fünf Tagen wurden Elektronentransportraten
(ETR) Werte bei Nickel-Konzentrationen zwischen 4.5 und 22.5 mg L-1 deutlich gehemmt.
Völlige Hemmung trat nach dieser Expositonszeit bei Konzentrationen von mehr als 22.5
mg L-1 auf. Die photosynthetische Leistungsfähigkeit (Fv`/Fm`) von an das Licht
angepassten E. gracilis zeigte eine signifikante Verminderung nach der Behandlung mit
einer Kadmium-Konzentration von 400 mg L-1. Nach fünf Tagen Expositionszeit war die
photosynthetische Effizienz bei Kadmium-Konzentrationen 50, 100 und 200 mg L-1 stark
vermindert und bei 400 mg L-1 vollständig gehemmt. Fünf Tage Inkubation von Euglena
bei Kadmium-Konzentrationen von 200 mg L-1 führten zu einer deutlichen Verminderung
der ETR und der photosynthetischen Effizienz. Bei 400 mg L-1 war keine
photosynthetische Aktivität mehr nachweisbar.
Die Ergebnisse zeigten eine vollständige Hemmung der photosynthetischen Effizienz bei
Zugabe von 75 mg L-1 Kupfer und Inkubationszeiten bis zu 2 Tag. Konzentrationen von 30
mg L-1 führten zu offensichtlichen Hemmungen im Fv`/Fm` während des gesamten
Experimentes. Bei dunkeladaptierten Proben wurde bei Zellen gemischt mit ≥ 10 mg L-1
Kupfer eine Verminderung von Fv/Fm beobachtet. Die Lichtkurven zeigten maximale
Hemmungen der Photosynthese in Gegenwart von 75 mg L-1 Kupferchlorid nach fünf
Tagen Inkubationszeit. Bei gleicher Inkubationszeit zeigten Zellen, die mit 30 mg L-1
behandelt wurden, eine deutliche Verminderung der photosynthetischen Effizienz und der
ETR. Die Reihenfolge der Schwermetallgiftigkeit für die Photosynthese ist Kupfer>
Nickel> Kadmium.
Alle geprüften Konzentrationen von PCP haben einen offensichtlichen Effekt auf die
gemessenen Fluoreszenz-Parameter. Hinzufügung von PCP mit Konzentrationen von 6 −
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25 mg L-1 zeigten deutliche Effekten sowohl auf Licht- als auch auf dunkeladaptierte
Proben bei fünftägiger Inkubation. In einer Konzentration von 25 mg L-1 reduzierte PCP
nach 24 Stunden die photosynthetische Effizienz auf Null, in beiden Proben. Bei 12.5 mg
L-1 PCP wurden sowohl die photosynthetische Effizienz erheblich reduziert. Sowohl
photosynthetische Effizienz als auch die ETR wurden durch nach PCP-Inkubation deutlich
beeinträchtigt. Diese Effekte korrelieren mit der PCP-Konzentration und der
Inkubationszeit (von 20 Minuten bis zu fünf Tagen).
2,4-DCP-Exposition mit Konzentrationen von ≥ 25 mg L-1 führten sofort zu deutliche
Effekte auf die photosynthetische Effizienz. Längere Inkubationszeitenverstärkten diesen
Effekt. 2,4-DCP Konzentrationen von ≥ 25 mg L-1 zeigten hoch signifikante Hemmung
sowohl des photosynthetischen Ertrags als auch der ETR nach 20 Minuten Inkubationszeit.
Längere Behandlungsdauer bis zu fünf Tage hemmten die ETR und die photosynthetische
Effizienz vollständig. Die Experimente zeigen, dass photosynthetische Parameter bei
Euglena in langfristigen Bioassays (fünf Tage) für die Bestimmung von Schwermetallen
und Chlorophenolgiftigkeit verwendet werden können.
Des Weiteren wurde der Einfluss von Schwermetallen auf die photosynthetischen
Experimente untersucht. Es stellte sich heraus, dass eine Methanolextraktion verbunden
mit vorsichtiger Ultraschallbehandlung für E. gracilis die am besten geeignete
Extraktionsmethode darstellt. Der Pigmentextrakt wurde anschließend mittels
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert, wobei deutlich fünf
Pigmente getrennt werden konnten: Chlorophyll a und b, sowie drei Karotinoide, nämlich
9-cis-neoxanthin und Diadinoxanthin und ß-Karotin.
Die Pigment-Zusammensetzung veränderte sich deutlich in Gegenwart von
Schwermetallen wie Kadmium und Kupfer. Bei Kupferinkubation wurden die
Konzentrationen von Chlorophyll b, ß-Karotin und 9-cis-neoxanthin im Vergleich zu
Diadinoxanthin und Chl a starker erniedrigt. Chl b, ß-Karotin sowie 9-cis-neoxanthin
waren bei einer Kupferkonzentration von 11 mg L-1 bei allen Inkubationszeiten deutlich
reduziert. Bei 24-stündiger Kupferchlorid-Inkubation in 37 bzw. 56 mg L-1 nahm die
Konzentration von Chlorophyll um ungefähr 35 − 40 % ab. Bei Inkubationszeiten von
mehr als vier Tagen zeigte sich bei allen Kupferkonzentrationen von 0.4 bis 56 mg L-1 eine
deutliche Abnahme der Chlorophyll-Konzentration. Nach 48 Stunden Inkubation in 11
bzw. 22 mg L-1 war der Diadinoxanthin-Gehalt deutlich reduziert und erholte sich auch im
Laufe der Inkubation nicht mehr.
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Weitere Ergebnisse zeigen, dass Chlorophyll b und ß-Karotin die empfindlichsten
Pigmente bei Inkubation in Kadmium sind. Bereits bei sehr niedrige Konzentrationen von
4 mg L-1 nach 24-stündiger Inkubation wurden diese deutlich reduziert. Die
Diadinoxanthin-Konzentrationen wurden nach vier Tagen Behandlung mit ≥ 25 mg L-1
Kadmium Konzentration signifikant reduziert. Der Chlorophyll a-Gehalt wurde durch
einer Kadmium Konzentration von ≥ 25 mg L-1 über vier Tage deutlich verringert. Diese
Effekte werden als das Ergebnis kombinierter Mechanismen, einschließlich des Ersatzes
des Mg in Chlorophyll-Molekülen und Bildung von Sauerstoffradikale (reactive oxygen
species, ROS) vermutet, die unter anderem die ungesättigten Fettsäuren in der
Thylakoidmembran zerstören. Infolgedessen werden in Chloroplast-Membranen gelegene
Komplexe des Pigment-Proteins zerstört.
Es wurden Konzentrations - und zeitabhängige Effekte auf extrahierte Pigmente bezüglich
der Schwermetallexposition vermessen. Die HPLC-Analyse hat bei der Behandlung mit
Kupfer, bei allen Inkubationszeiten, eine Verminderung der Konzentration von
extrahiertem Chlorophyll auf ≥ 2.5 mg L-1 ergeben. Das extrahierte Chlorophyll b, das ß-
Karotin sowie der Xanthophyll-Gehalt wurden nach verschiedenen Behandlungszeiten mit
≥ 5 mg L-1 Kupferkonzentration sehr deutlich vermindert. Die Behandlung mit Kadmium ≥
7 mg L-1 zeigte eine signifikante Verminderung aller extrahierten Pigmente von E. gracilis
bei allen Behandlungsdauern.
Zusammenfassend kann man sagen, dass sowohl Karotenoide als auch Chlorophyll b
wahrscheinlich eine Rolle beim Schutz der Chloroplaste gegen Effekte durch
Schwermetallbelastung spielen. Deshalb ist die Analyse photosynthetischer Pigmenten von
Euglena als Endpunkt eines Bioassays geeignet, da diese empfindlich und schnell auf
Schwermetalle bei ökologisch relevanten Konzentrationen reagieren.
Die gegenwärtige Studie zeigt, dass der untersuchte Bioassay-Musterorganismus Euglena
gracilis bedeutende Antwort auf alle geprüften Wasserschadstoff-Klassen durch Analyse
des Bewegungsverhaltens, der photosynthetischen Aktivität und schließlich durch Analyse
der photosynthetischen Pigmente liefern kann. Zuverlässigkeit, Empfindlichkeit, geringe
Kosten und eine kurze Reaktionszeit bei der Überwachung von Wasserproben auf
Schadstoffe sind die Vorzüge des untersuchten Testsytems mit dem Organismus Euglena
gracilis. Insbesondere verschiedene Motiliätsparameter können automatisch, nach bereits
kurzer Expositionszeit, untersucht werden. Photosynthetische Parameter und die
Pigmentzusammensetzung liefern in Abhängigkeit von der Schadstoffkonzentrationen,
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