Beziehungen zwischen Membranpermeabilität, Ionengehalt und Stoffwechsel nach Einwirkung ionisierender Strahlen PDF
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FORSCHUNGSBERICHT DES LANDES NORDRHEIN -WESTF ALEN Nr. 2539/Fachgruppe Medizin/Biologie Herausgegeben im Auftrage des Ministerprasidenten Heinz Kuhn vom Minister fUr Wissenschaft und Forschung Johannes Rau Priv. Doz. Dr. Hermann Rink Prof. Dr. Hans-Dietrich Bergeder Abteilung fUr Strahlenbiologie im Institut fur Biophysik der UniversiUit Bonn Beziehungen zwischen MembranpermeabiliHit Ionengehalt und Stoffwechsel nach Einwirkung ionisierender Strahlen Westdeutscher Verlag 1976 © 1976 by Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen Gesamtherstellung: Westdeutscher Verlag ISBN-13: 978-3-531-02539-1 e-ISBN-13: 978-3-322-88086-4 DOl: 10.1007/978-3-322-88086-4 Inha1tsverzeichnis 1. .Ein1eitung 3 1.1 E1ektro1ytverschiebungen nach Strah1eneinwirkung 3 1.2 Fhysio1ogische Bedeutung eines unge storten E1ektro1ythausha1tes 5 1.3 Frob1eIDste11ung 6 2. SysteIDatische Untersuchungen zur Beein flus sung der strah1enbedingten E1ektro lytverschiebungen 8 2.1 E1ektro1ytverschiebungen in Abhangigkeit von der Strah1endosis und der Suspen sionszeit 9 2.2 E1ektro1ytverschiebungen in Abhangigkeit VOID Wasser- und 02-Geha1t 12 2.3 E1ektro1ytverschiebungen in Abhangigkeit VOID pH-Wert 12 2.4 E1ektro1ytverschiebungen in Abhangigkeit VOID K+-Konzentrationsgradienten 14 2.5 E1ektro1ytverschiebungen in Abhangigkeit VOID Stoffwechse1zustand und VOID Substrat angebot 15 Fo1gen strah1enbedingter E1ektro1ytver schiebungen auf den Stoffwechse1 16 3.1 Auswirkungen auf den Azetatstoffwechse1 18 3.2 Auswirkungen auf den Azeta1dehydstoff wechse1 23 Auswirkungen auf den Athano1stoffwechse1 26 Zusammenste11ung der Befunde und Dis kussion 29 4. Bi1anzen der K+-Na+-Verschiebungen 32 4.1 Ergebnisse 33 4.2 Zusammenste11ung der Befunde und Dis kussion 37 5. Ursachen strah1enbedingter Elektro1yt verschiebungen 38 SH-Gruppen an der Ze11oberf1ache 39 5.1.1 Bestimmung membrangebundener SH-Gruppen und deren Beeinflussung durch Bestrah- lung 39 5.1.2 Elektrolytverschiebungen durch SH- blockierende Agentien 42 5.1.3 Beeinflussung der strahlenbedingten Elektrolytverschiebungen durch SH-Substanzen (Glutathion, GSH) 43 5.1.4 Zusammenstellung der Befunde 45 5.2 De~+Einfluss deszellularen Ca -Gehaltes 46 5.2.1 K+-Na+-Verschiebun~en bei Variation des zellularen Ca+ -Gehaltes 47 5.2.2 Bindun~~ Verdrangung und Entzug von Ca -Ionen 49 5.2.3 Zusammenstellung der Befunde und Diskussion 52 6. Zusammenfassung 54 7. Literaturverzeichnis 56 2 1. Ein1ei tung Die Einwirkung ionisierender Strah1en auf 1ebende Organismen fuhr t zu zah1reichen Veranderungen. Auf zellularer Ebene treten vor al1em zwei Erscheinungen in den Vordergrund, die getrennt voneinander betrachtet werden muss en. Die erste Frage gilt der Einschriinkung oder dem Verlust der Vermeh rungsfahigkeit nach Strah1eneinwirkung (.r.eproductive death). Sie werden im wesentlichen durch eine Strahlenschadigung der DNA verursacht und sind in starkem MaBe von der Strahlenemp findlichkeit des untersuchten Objektes und den Bestrahlungs bedingungen (Strah1enart, Dosisleistung, Ionisationsdichte, 02-Geha1t u.a.) abhangig. Die zweite Frage gilt der ruhenden, sich nicht teilenden Zel le (interphase death). In diesem Zusammenhang werden stark differenzierte Ze11en ohne Pro1iferationsvermogen oder Zel1en, deren Milieubedingungen keine Teilung zulassen, betrachtet. FUr Untersuchungen des Strahleneinflusses auf die letztge nannten Zellarten bieten sich die Parameter des Energiestoff wechse1s und/oder die Zellpermeabi1itat an. FUr die Unter suchung beider Grossen spielen strahlenbedingte E1ektrolyt verschiebungen eine besondere Rolle: Fur Permeabi1itatsan derungen sind sie ein gut faBbares und empfindliches Krite rium. Mit dem Energiestoffwechsel hang en sie direkt und indi rekt zusammen. Einerseits ist zur Aufrechterhaltung der 10- nengradienten stets Stoffwechselenergie und eine intakte Membran erforder1ich, andererseits sind einige Enzyme des Energiestoffwechsels von bestimmten intrazellu1aren Ionen konzentrationen abhangig. Aus diesen GrUnden sind Unter suchungen tiber den Zusammenhang zwischen strahlenbedingten Elektro1ytverschiebungen, Permeabilitatsanderungen und Be- . en . des Stoffwechse1s besonders e~nf1ussung ~nteressant. 1.1 Elektro1ytverschiebungen nach Strahleneinwirkung Werden erregbare Gewebe bestrahlt, so lassen sich bei be stimmten Objekten sofort nach Beginn der Bestrahlung Reak tionen beobachten. Dabei konnte es sich um Auslosung oder Anderung von Erregungsablaufen hande1n, also um Prozesse, 3 die an Membranen gebunden sind und eine entsprechende Ionen verteilung voraussetzen. Die Beobachtung solcher Vorgange fti~ te zur Untersuchung von Anderungen des Membranpotentials und der Ionenverteilung nach Strahleneinwirkung. Strahlenbedingte Elektrolytverschiebungen sind jedoch nicht auf erregbare Ge webe beschrankt, sondern konnen bei vielen Zellen, Organen, Organismen und subzellularen Einheiten beobachtet werden. Die I onenverschiebungen, die nach Bestrahlung auftreten, bestehen im wesentlichen in einer Abgabe von K+-Ionen und einer Auf - nahme von Na+-Ionen. Es handelt sich also um Verschiebungen im Sinne eines Abbaus bestehender Konzentrationsgradienten(4). 1m ganzkorperbestrahlten Individuum konnen derartige Untersu chungen nur schlecht - oder nur mit grossem Aufwand - durchge ftihrt werden (46). Zu viele Parameter, die die Zellpermeabili tat und die Ionenverteilung mit beeinflussen, bleiben dabei unbekannt bzw. unberlicksichtigt, so dass eine klare Analyse der Vorgange nach Bestrahlung, insbesondere eine Differen zierung nach Ursachen und Folgen undurchftihrbar ist. Eine K+-Konzentrationsanderung im Serum kann nur schwer nachgewie sen werden, wenn z.B. nur wenige strahlenempfindliche Organe i+-Ionen verlieren und diese im Gesamtserum schnell verdtinnt und evtl. tiber die Niere ausgeschieden werden. Die tiberge ordneten Mechanismen der nervosen und hormonal en Regulation, die ihrerseits den Elektrolytstoffwechsel beeinflussen, spie len dabei eine bedeutende Rolle (18). Dadurch konnen strah lenbedingte Veranderungen, zumindest in frlihen Phasen, tiber lagert sein und dem Nachweis entgehen. Der Befund, dass die strahlenresistente Muskulatur nach in-vivo-Bestrahlung ihren K+-Gehalt erhoht, ist offenbar Ausdruck einer solchen Regu lation (3). Das Vorliegen verschieden strahlenempfindlicher Zellpopulati onen gibt weitere Probleme auf, die bei der Untersuchung iso lierter Zellen nicht gegeben sind. Lymphozyten und Zellen des Dlinndarmepithels sind wesentlich strahlenempfindlicher und zeigen frliher morphologische und biochemische Veranderungen als z.B. Retikulumzellen oder Muskelzellen (43). Elektrolyt veranderungen im Plasma spiegeln deshalb immer die Elektro lytverschiebungen resistenter u n d sensibler Zellen wieder, moglicherweise tiberlagert durch Elektrolytfreiset zung aus total zerstorten Zellen. 4 Systeme von Einzellern besitzen demgegenuber eine ganze Reihe methodischer Vorteile, die sie fur Untersuchungen uber Folgen und Ursachen strahlenbedingter Elektrolytverschiebungen geeig net erscheinen lassen. Hefezellen z.B. zeigen keine frlihen morphologischen Veranderungen; ihr Stoffwechsel ist gut be kannt und der intrazellulare Elektrolytgehalt lasst sich auch ohne Strahleneinwirkung durch geeigneteMilieubedingun gen variieren. Sie sind zumindest gute Modellobjekte, an de nen grundsatzliche Zusammenhange studiert werden konnen. 1.2 Physiologische Bedeutung eines ungestorten Elektrolythaushaltes Fast allen Zellen ist ein Merkmal gemeinsam: Der intrazellu lare K+-Gehalt ist hoher, der intrazellulare Na+-Gehalt ist geringer als in der umgebenden Flussigkeit. Der intrazellu lare K+- und Na+-Gehalt ist fur einzelne Zelltypen charak teristisch und zum Teil genetisch bedingt (45). - Abwei chungen von der Norm haben meist eine pathologiscne Urs& che. Verschiedene Lebensvorgange sind offenbar an bestimmte Ionenkonzentrationen gebunden. Die Gesamtkonzentration und die Zusammensetzung der Salzmischung sowie das Verhaltnis der einzelnen Salze zueinander ist fur den geordneten Ab lauf der Lebensvorgange eine unerlassliche Vorausset- zung (21). Diese allgemeine Aussage wird durch eine FUlle verschiedener Funktionen belegt, bei denen K+-Ionen und/oder Na+-Ionen mit wirken (38). Vielfach spielen dabei K+-aktivierbare Enzym systeme eine Rolle, von denen ca. 100 bekannt sind (38). Gerade das als so wichtig erkannte aquilibrierte Ionenmilieu des Organismus wird nun aber nach Strahleneinwirkung empfind lich gestort, und zwar im Sinne einer zunehmenden Entropie. Die Konzentrationsgradienten werden abgebaut. 5 Problemstellung Viele Autoren haben sich mit dem Problem der strahlenbeding ten Elektrolytverschiebungen be£asst. Das Bild ist ausserst viel£altig geworden, jedoch ist eine abschliessende Klarung bis heute nicht moglich gewesen. Zusammenhange zwischen strah lenbedingten Elektrolytverschiebungen und Erregungsablau£en, Potentialanderungen, Storungen des Energiesto££wechsels (6), ja selbst strahlenbedingtem Zelltod und dem Tod ganzkorper bestrahlter Tiere (16) wurden untersucht und diskutiert. Die Untersuchungen wurden jedoch unter den verschiedensten Bestrahlungsbedingungen ~u unterschiedlichen Zeiten nach der Strahleneinwirkung und bei einer mannig£altigen Zahl von Zel len, Organen und Organismen durchge£uhrt. Von wenigen Ausnah men (Erythro&yten) abgesehen, kann trotz der viel£altigen Ein zelbeobachtungen kein systematischer Uberblick gegeben wer den (24,42, 44). Das Spektrum der Au££assungen reichte frlihzeitig von der Dar stellung der Elektrolytverschiebungen als sekundare Begleit erscheinung bis zur Vermutung, dass durch dieses Ereignis weitere Prozesse, insbesondere auf der Ebene des Zellsto£f wechsels ausgelost werden (1). Diese grundsatzliche Frage wird hier aufgegri£fen und weiter differenziert. Die haufig angeschnittene Frage, ob es zu strahlenbedingten Elektrolytverschiebungen kommt, weil der Energiestof£wechsel, der die standig notwendige Energie zur Aufrechterhaltung der Konzentrationsgradienten liefern muss, versagt - oder ob un abhangig vom Energiesto££wechsel eine Membranstrukturanderung vorliegt, die zu Permeabilitatsanderungen und damit zu Ionen verschiebungen £Uhrt, ist zwar haufig diskutiert, aber nur von wenigen Autoren direkt oder indirekt belegt worden. Zum anderen stellt sich die Frage, ob strahlenbedingte Elek trolytverschiebungen ihrerseits Folgen auf den Stof£wechsel haben konnen. Dieses Problem wurde bereits 1957 von Bergeder (1) aufgewor fen. Da die Aktivitat einiger Enzyme durch K+-Ionen akti viert und zum Teil durch Na+-Ionen gehemmt wird., konnten sich Ionenverschiebungen nach Bestrahlung in doppelter Weise auswirken. Sowohl der Verlust aktivierender K+-Ionen 6 als auch die Zunahme hemmender Na+-1onen konnten zu einer Minderung von Enzymaktivitaten in vivo und einem reduzierten Energiestoffwechsel flihren. Strahlenbedingte Elektrolytver schiebungen konnten damit ihrerseits zum Ausgangspunkt wei terer sekundarer Veranderungen werden. Auf die Frage nach der Beeinflussung K+-Na+-abh8.ngiger En zymaktivitaten sind zwei Autoren indirekt eingegangen. Roth stein (41) flihrt die negativen Auswirkungen einer Bestrah lung auf die aerobe und anaerobe Glykolyse von Hefezellen auf strahlenbedingte K+-Verluste zurlick. Eine eingehende Untersuchung blieb jedoch aus. Bresciani, Dose und Rajews ky (9) diskutieren die strahlenbedingte Glykolysehemmung von Ehrlich-Aszites-Tumorzellen im Zusammenhang mit Elektrolyt verschiebungen, die sich auf den Stoffwechsel auswirken sollen. Eine genauere Untersuchung wurde von Rink am Beispiel des Azetatstoffwechsels von Hefen durchgefuhrt. Dabei wurde ge zeigt, in welchem AusmaB das A,zetat umsetzende Enzym Azetyl CoA-Synthetase (EC 6.2.1.1) unter in-vivo-ahnlichen Bedin gungen durch K+-1onen aktiviert und durch Na+-1onen ge hemmt wird (5, 26). Auf Grund dieser Ergebnisse und den be kannten strahlenbedingten Elektrolytverschiebungen wurde ge schlossen, dass nach entsprechend dosierter Bestrahlung die Enzymaktivitat gehemmt musste. Tatsachlich fand sich in se~ bestrahlten Zellen (200 kB') in Abhangigkeit von der Suspen sionszeit nach Bestrahlung ein Anstieg des intrazellularen Azetatspiegels als Anzeichen einer Hemmung des Azetatumsat zes. Da die aus den bestrahlten Zellen isolierte Azetyl-CoA Synthetase unter optimalen in-vitro-Bedingungen die gleiche Aktivitat zeigte wie das aus unbestrahlten identischen Kon trollproben gewonnene Enzym, musste die Hemmung des Azetat umsatzes auf die strahlenbedingten Elektrolytverschiebungen und deren Auswirkungen auf die Enzymaktivitat zurlickgeflihrt werden (27). 1m Rahmen dieser Arbeit werden an Hefezellen grundsatzliche Mechanismen der Strahlenwirkung untersucht. 7
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