AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MICROBICIDA DAS FOLHAS DA ESPÉCIE Ayapana triplinervis Vahl.

113 Pages·2014·2.8 MB·Portuguese

by  Tamyris Lopes

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MICROBICIDA DAS FOLHAS DA
ESPÉCIE Ayapana triplinervis Vahl.

Tamyris Regina Matos Lopes

BELÉM – PA
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MICROBICIDA DAS FOLHAS DA
ESPÉCIE Ayapana triplinervis Vahl.

Autora: Tamyris Regina Matos Lopes
Orientadora: Profª. Drª. Marta Chagas Monteiro
Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Cristina Baetas Gonçalves

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração:
Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Pará, como requisito parcial
para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.

BELÉM – PA
2014
FICHA CATALOGRÁFICA

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciências da Saúde – UFPA

Lopes, Tamyris Regina Matos.
Avaliação do potencial microbicida das folhas da espécie Ayapana triplinervis
Vahl. / Tamyris Regina Matos Lopes ; orientadora, Marta Chagas Monteiro, co-
orientadora, Ana Cristina Baetas Gonçalves. — 2014

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da
Saúde, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Belém, 2014.

1. 1. Ayapana triplinervis. 2. Plantas Medicinais. 3. Ação Antimicrobiana. I.
Título.

CDD. 22.ed. : 615.321
FOLHA DE APROVAÇÃO

Tamyris Regina Matos Lopes

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MICROBICIDA DAS FOLHAS DA
ESPÉCIE Ayapana triplinervis Vahl.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração:
Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Pará, como requisito parcial
para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.

Aprovado em: 06/12/2013

Banca examinadora:

_________________________________________
Profa. Dra. Ana Cristina Baetas Gonçalves – UFPA

_________________________________________
Prof. Dr. José Maria dos Santos Vieira – UFPA

_________________________________________
Profa. Dra. Marcieni Ataide de Andrade– UFPA
(Suplente)

_________________________________________
Profa. Dra. Marta Chagas Monteiro – UFPA
Orientadora
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 01
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 03
2.1 PLANTAS MEDICINAIS ..................................................................................... 03
2.2 MEDICINA TRADICIONAL NO BRASIL ......................................................... 04
2.3 ESPÉCIE AYAPANA TRIPLINERVIS VAHL. ...................................................... 06
2.3.1 Ayapana triplinervis V. e seu uso empírico no mundo e no Brasil ............ 06
2.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ..................................................................... 11
2.4.1 Principais bactérias importantes na clínica associados ao mecanismo de
resistência ....................................................................................................... 15
2.4.1.1 Staphylococcus aureus ........................................................................... 16
2.4.1.2 Enterococcus faecalis ............................................................................. 18
2.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa ....................................................................... 22
2.4.1.4 Escherichia coli ...................................................................................... 24
2.4.1.5 Proteus mirabilis .................................................................................... 25
2.4.1.6 Klebsiella pneumoniae ........................................................................... 26
2.5 DESENVOLVIMENTO DE FÁRMACOS A PARTIR DE PLANTAS .............. 27
3 OBJETIVOS ............................................................................................................. 29
3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 29
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 29
4 MATERIAL E MÉTODO. ...................................................................................... 30
4.1 TRATAMENTO PRELIMINAR DO MATERIAL VEGETAL. ......................... 30
4.1.1 Coleta do material botânico ......................................................................... 30
4.1.2 Limpeza, secagem e preparo do material vegetal ...................................... 30
4.1.3 Obtenção dos extratos hexânico, de acetato de etila, metanólico e
hidroalcoólico ................................................................................................. 30
4.1.4 Obtenção das frações do extrato metanólico .............................................. 31
4.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA. .................................... 34
4.2.1 Obtenção e manutenção das cepas testadas. ............................................... 34
4.2.2 Preparo dos meios de cultura ....................................................................... 36
4.2.3 Preparo dos inóculos bacterianos ................................................................. 36
4.2.4 Avaliação da atividade antimicrobiana dos diferentes extratos de A.
triplinervis V. frente a bactérias gram-negativas e gram-positivas pela
técnica de microdiluição ................................................................................ 36
4.2.5 Detecção da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ............................... 39
4.2.6 Contagem da Concentração Bactericida Mínima (CBM) ......................... 40
5 RESULTADOS ......................................................................................................... 41

Resultados com os extratos de Ayapana triplinervis
5.1 ANÁLISE FITOQUÍMICA ................................................................................... 41
5.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA FRENTE À S. AUREUS ............................. 42
5.3 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA FRENTE À E. FAECALIS ......................... 43
5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA FRENTE À E. COLI .................................. 45
5.5 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA FRENTE À P. AERUGINOSA ................... 47

Resultados com as frações do extrato metanólico de Ayapana triplinervis
5.6 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS FRAÇÕES DO EXTRATO
METANÓLICO FRENTE A BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS
5.6.1 Escherichia coli - ATCC 8739 ....................................................................... 49
5.6.2 Escherichia coli – Isolado Clínico .................................................................. 52
5.6.3 Pseudomonas aeruginosa – ATCC 25853 .................................................... 53
5.6.4 Proteus mirabilis e Klebsiella pneumoniae– ATCC 15290 e 10031 ............ 54
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 56
7 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 67
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 68
LISTA DE FIGURAS

Página
Figura 1 - Fotografia da espécie Ayapana triplinervis V. 7
Figura 2 - Estrutura básica das cumarinas. 10
Figura 3 - Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de 11
metabólitos secundários nas plantas.
Figura 4 - Estruturas químicas de compostos antimicrobianos 13
comumente encontrados em plantas
Figura 5 - Componentes estruturais de S. aureus. Fonte: Adaptado de 17
Lowy, 1998. O painel A mostra a superfície e as proteínas
secretoras. A síntese de muitas destas proteínas depende da
fase de crescimento, como mostra o gráfico, e é controlada
por genes regulatórios. O painel B e C mostra segmento do
envelope celular. TSST-1 simboliza a toxina do choque
tóxico.
Figura 6 - Esquema de empacotamento da cromatografia em coluna. 32
Figura 7 - Esquema de eluição da cromatografia camada delgada 34
Figura 8 - Bactérias em meio específico. A. S. aureus semeado em 35
ágar manitol; B. E. faecalis em ágar sangue; C. E. coli em
ágar Mac-Conkey e D. P. aeruginosa em ágar cetrimide.
Figura 9 - Representação esquemática simplificada da microdiluição 37
em placas de 96 poços para determinação da Concentração
Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida
Mínima (CBM).
Figura 10 - Esquema representativo da Diluição de extratos e frações 38
– de eppendorfs aos poços.
Figura 11 - Representação esquemática simplificada da microplacas de 38
96 poços na microdiluição dos diferentes extratos – 1ª
etapa de experimentos. A. 500 µg/mL; B. 250 µg/mL; C.
125 µg/mL; D. 62,5 µg/mL; E. 31,3 µg/mL.
Figura 12 - Representação esquemática simplificada da microplacas de 39
96 poços na microdiluição das frações do extrato
metanólico. 2ª etapa de experimentos. A. 500 µg/mL; B.
250 µg/mL; C. 125 µg/mL; D. 62,5 µg/mL; E. 31,3 µg/mL.
Figura 13 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 42
Bactericida Mínima (CBM) do Extrato Metanólico de A.
triplinervis V. frente a S. aureus (ATCC 6538).
Figura 14 - Controle de crescimento positivo S. aureus (ATCC 6538). 42
Figura 15 - Concentração inibitória mínima (CIM) e menor 43
concentração testada do Extrato Hidroalcoólico de A.
triplinervis V. frente a E. faecalis (ATCC 29212).
Figura 16 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e maior 43
concentração testada do Extrato Metanólico de A.
triplinervis V. frente a E. faecalis (ATCC 29212).
Figura 17 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e menor 44
concentração testada do Extrato Acético de A. triplinervis
V. frente a E. faecalis (ATCC 29212).
Figura 18 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e menor 44
concentração testada do Extrato Hexânico de A.
triplinervis V. frente a E. faecalis (ATCC 29212).
Figura 19 - Inóculo e DMSO 10%. frente a E. faecalis (ATCC 29212). 45
Figura 20 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 45
Bactericida Mínima (CBM) do Extrato Hidroalcoólico de
A. triplinervis V. frente a E. coli (ATCC 8739).
Figura 21 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 46
Bactericida Mínima (CBM) do Extrato Metanólico de A.
triplinervis V. frente a E. coli (ATCC 8739).
Figura 22 - Concentração Bactericida Mínima (CBM) e maior 46
concentração testada do Extrato de Acetato de Etila de A.
triplinervis V. frente a E. coli (ATCC 8739).
Figura 23 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 47
Bactericida Mínima (CBM) do Extrato Hexânico de A.
triplinervis V. frente a E. coli (ATCC 8739).
Figura 24 - Inóculo e DMSO 10%. frente a E. coli (ATCC 8739). 47
Figura 25 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 48
Bactericida Mínima (CBM) do Extrato Hidroalcoólico de
A. triplinervis V. frente a P. aeruginosa (ATCC 25853).
Figura 26 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e maior 48
concentração testada do Extrato Metanólico de A.
triplinervis V. frente a P. aeruginosa (ATCC 25853).
Figura 27 - Inóculo e DMSO 10%. frente a P. aeruginosa (ATCC 49
25853).
Figura 28 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 50
Bactericida Mínima (CBM) da Fração 1 do Extrato
Metanólico de A. triplinervis V. frente a E. coli (ATCC
8739).

Figura 29 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) da Fração 3 do 50
Extrato Metanólico de A. triplinervis V. frente a E. coli
(ATCC 8739).
Figura 30 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 51
Bactericida Mínima (CBM) da Fração 4.1 do Extrato
Metanólico de A. triplinervis V. frente a E. coli (ATCC
8739).
Figura 31 - DMSO 10% e penicilina-streptolisina mostrando 100% de 51
morte bacteriana.
Figura 32 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 52
Bactericida Mínima (CBM) da Fração 3 do Extrato
Metanólico de A. triplinervis V. frente a E. coli
(ISOLADO CLÍNICO).
Figura 33 - Controle de crescimento positivo de E. coli (ISOLADO 52
CLÍNICO) com DMSO 10% e penicilina-estreptolisina
com morte de 100% das bactérias.
Figura 34 - Concentração Inibitória Mínima (CIM) da Fração 3 do 53
Extrato Metanólico de A. triplinervis V. frente a
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25853.
Figura 35 - Controles do ensaio com Pseudomonas aeruginosa. (a.) 53
DMSO 10 e (b.) Antibiótico.
Figura 36 - Controles do ensaio com Proteus mirabilis. (a.) DMSO 54
10% e (b.) Antibiótico.
Figura 37 - Controles do ensaio com Klebsiella pneumoniae ATCC 54
0000. (a.) DMSO 10% e (b.) Antibiótico.
Figura 38 - Metabólitos secundários isolados de Ayapana triplinervis 56
V.: aiapanina (1), aiapina (2), dafnetina (3), dimetil éter
dafnetina (4), metil-7-éter dafnetina (5), hidrangetina (6),
umbeliferona (7), estigmasterol (8), éter metil timol (9),
éter dimetil timoquinol (10), e timoquinona (11).

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