avaliação da atividade antiviral de extratos vegetais e de fungos contra dengue virus.

130 Pages·2016·6.13 MB·Portuguese

Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS VEGETAIS
E DE FUNGOS CONTRA DENGUE VIRUS.
por

Emerson de Castro Barbosa

Belo Horizonte
Fevereiro/2015
DISSERTAÇÃO MBCM-CPqRR E.C. BARBOSA 2015
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS VEGETAIS
E DE FUNGOS CONTRA DENGUE VIRUS.
por

Emerson de Castro Barbosa

Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências da Saúde do
Centro de Pesquisas René Rachou, como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências - área de concentração
Biologia Celular e Molecular.
Orientação: Dra. Jaquelline Germano de
Oliveira

Belo Horizonte
Fevereiro/2015
II
Catalogação-na-fonte
Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ
Biblioteca do CPqRR
Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975
B238a Barbosa, Emerson de Castro.
2015
Avaliação da Atividade Antiviral de Extratos
Vegetais e de Fungos contra Dengue Virus / Emerson
de Castro Barbosa. – Belo Horizonte, 2015.

XV, 115 f: il.: 210 x 297 mm.

Bibliografia: 117 - 130
Dissertação (mestrado) – Dissertação para
obtenção do título de Mestre em Ciências pelo
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de
concentração: Biologia Celular e Molecular.

1. Dengue/terapia 2. Flaviviridae/patogenicidade 3.
Produtos Biológicos/uso terapêutico. Título. II.
Oliveira, Jaquelline Germano de (Orientação).

CDD – 22. ed. – 616.918 52

III
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS VEGETAIS
E DE FUNGOS CONTRA DENGUE VIRUS.
por

Emerson de Castro Barbosa

Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:

Dra. Jaquelline Germano de Oliveira (CPqRR/FIOCRUZ) Presidente
Dra. Betania Barros Cota (CPqRR) Titular
Dra. Erna Geessien Kroon (UFMG) Titular
Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal (CPqRR) Suplente

Dissertação defendida e aprovada em 24/02/2015

IV
Aprender é a única coisa de que a
mente nunca se cansa, nunca tem
medo e nunca se arrepende.
Leonardo da Vinci
V
AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, Dra. Jaquelline Germano de Oliveira, pela dedicação,
confiança, incentivo e aprendizado. Certamente, ela foi a principal responsável por
aguçar meu desejo em compreender o mundo intrigante e desafiador da ciência;

Aos pesquisadores do LICM, Dr. Rodrigo Correa Oliveira, Dr. Carlos Eduardo
Calzavara Silva, Dra. Érica Rocha e Dra. Soraya Gaze;

À Clari, secretária do ICM, que sempre me protegeu e mimou com balas, pirulitos,
doces e travessuras. Seu cuidado e preocupação comigo sempre foram os mesmos
que uma avó tem com o neto. Com ela meus dias no laboratório ficaram mais leves,
divertidos e impossíveis de esquecer;

À equipe técnica admistrativa do ICM, Luciana Lisboa, Vinícius Sampaio, Ana
Pacheco e Ricardo Andrade pelo apoio;

À professora Dra. Erna G. Kroon, pela orientação, pelas valiosas discussões na
realização dos ensaios biológicos e pelo acolhimento em seu laboratório para meu
treinamento em técnicas de virologia, fornecimento de reagentes e amostras de
células e de Dengue virus;

Aos pesquisadores do Laboratório de Química de Produtos Naturais (LQPN), Dra.
Tânia Maria de Almeida Alves e Dr. Carlos Leomar Zani pela disponibilidade,
orientação, incentivo e pelas valiosas discussões no decorrer do trabalho;

À equipe técnica do LQPN, Fernanda Luiza de Melo Francisco pela preparação dos
extratos e à Daniela Nabak pela ajuda e cooperação;

Ao pesquisador Dr. Luiz H. Rosa e equipe, do Departamento de Microbiologia da
Universidade Federal de Minas Gerais, pelas discussões e colaboração;

VI
Ao João Rodrigues, Dra. Alessandra Ruiz, Dr. Eliseu Rocha, do Laboratório de vírus
do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, pelo treinamento em virologia, cultivo
celular e sugestões para a realização deste trabalho;

À pesquisadora Dra. Laura Gil do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM)
– Fiocruz Pernambuco, pelas sugestões e contribuição a este projeto.

Ao Danilo Silvério Gontijo pela atenção, disponibilidade e preparo dos cálculos em
planilhas do Excel;

Às alunas de Iniciação Científica, Marcelle Guimarães e Gabriela Casagrande pela
contribuição no desenvolvimento do projeto;

À Juliana Bellardini, atual aluna de Iniciação Científica, pela dedicação e ajuda na
execução dos experimentos;

Ao pesquisador Dr. Policarpo Ademar Sales pela disponibilidade na discussão dos
resultados e sugestões;

Aos colegas e amigos do curso do mestrado, em especial à Anna Carolina Cançado
e à Luiza Guimarães Tunes pela ajuda, cooperação e apoio;

À toda equipe do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular (ICM), pós doutores,
estudantes de pós graduação e alunos de iniciação científica que foram meus
companheiros, receptivos, calorosos e dispostos a ajudar em todos os momentos;

À toda a equipe da secretaria acadêmica do CPqRR pelo apoio e atenção;

À toda minha família e amigos queridos, em especial Rafael Coelis, que entenderam
a minha ausência em diversos momentos de dedicação a este trabalho;

E a minha gratidão sincera a todos que de alguma forma contribuíram para esta
realização.
VII
AGRADECIMENTOS ÀS INSTITUIÇÕES FINANCEIRAS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
financiamento da bolsa de mestrado;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
financiamento do projeto, intitulado “Avaliação da Atividade Antiviral de Extratos
Vegetais e de Fungos contra Dengue virus”. Número do processo: 474139/2010-7;

Ao apoio financeiro do projeto PROEP/CNPq/CPqRR intitulado “Busca de hits a
partir de produtos naturais para o desenvolvimento de drogas contra leishmaniose,
doença de Chagas, câncer, dengue e influenza”;

Ao apoio técnico-financeiro da plataforma tecnológica PDTIS/Fiocruz RPT10A
(plataforma de Bioprospecção MG).

VIII
SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XI 
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ XII 
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ............................................................. XIII 
RESUMO................................................................................................................. XIV 
ABSTRACT .............................................................................................................. XV 
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16 
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 18 
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 18 
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 18 
3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 19 
3.1 Dengue ............................................................................................................ 19 
3.2 Dengue virus (DENV) ....................................................................................... 21 
3.3 Transmissão do DENV ..................................................................................... 26 
3.4 Infecção e multiplicação do DENV ................................................................... 28 
3.5 Epidemiologia da Dengue ................................................................................ 30 
3.6 A Dengue no Brasil .......................................................................................... 32 
3.7 Prevenção e Tratamento da Dengue ............................................................... 34 
3.8 A Biodiversidade como fonte de antivirais ....................................................... 36 
3.9 Fungos e plantas como fonte de antivirais contra DENV ................................ 41 
4 FLUXOGRAMA DO TRABALHO ............................................................................ 45 
5 MÉTODOS ............................................................................................................. 46 
5.1 Linhagens celulares e vírus ............................................................................. 46 
5.2 Multiplicação de DENV-2 em células C6/36 para obtenção de estoque viral
(pool trabalho) ........................................................................................................ 46 
5.3 Titulação de DENV-2 em células BHK-21 pelo método de formação de placas
de lise (Dulbecco & Vogt, 1953) ............................................................................. 47 
5.4 Extratos de plantas e de fungos da extratoteca Colab da Fiocruz Minas ........ 49 
IX
5.5 Triagem da atividade antiviral de extratos de plantas e fungos contra DENV-2
por avaliação do ECP viral por microscopia óptica ................................................ 50 
5.6 Triagem da atividade antiviral de extratos de plantas e fungos contra DENV-2
pelo método do MTT .............................................................................................. 51 
5.7 Determinação da CE dos extratos de plantas e fungos com atividade antiviral
50
............................................................................................................................... 52 
5.8 Determinação da CC dos extratos contra DENV-2 por microscopia óptica e
50
pelo MTT ................................................................................................................ 54 
5.9 Cálculo do Índice de Seletividade (IS) ............................................................. 55 
6 RESULTADOS ....................................................................................................... 56 
6.1 Produção e titulação do pool trabalho de DENV-2 ........................................... 56 
6.2 Triagem de extratos de plantas e fungos com atividade antiviral ..................... 56 
6.3 Determinação da concentração efetiva 50 (CE ) ............................................ 64 
50
6.4 Determinação da concentração citotóxica 50 (CC ) ....................................... 68 
50
6.5 Seleção dos extratos fúngicos promissores para recultivo ............................. 70 
7 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 80 
8 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ...................................................................... 90 
9 ANEXOS ................................................................................................................ 91 
9.1 Artigo 1 ............................................................................................................. 91 
9.2 Artigo 2 ........................................................................................................... 103 
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 117 

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