Attraction des Cellules sur Micro- aimants

200 Pages·2014·8.57 MB·French

Thèse de l’Université de Lyon
Délivrée par l’Ecole Centrale de Lyon
Pour obtenir le grade de DOCTEUR
Par

Osman OSMAN

Spécialité : « Ingénierie pour le vivant »

Ecole doctorale : ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

Attraction des Cellules sur Micro-
aimants: Applications au Suivi de
l’Endocytose et au Tri Cellulaire

Soutenue le 25 Avril 2014 devant le Jury composé de :

M. CUGAT Orphée Directeur de recherche CNRS, Président/
Laboratoire G2ELab, Grenoble Rapporteur

M. NADI Mustapha Professeur – Université de Lorraine, Rapporteur
Vandoeuvre Les Nancy

M. RENAUD Louis Maître de Conférences – Université Examinateur
Claude Bernard Lyon 1

M. DUMAS-BOUCHIAT Maître de Conférences – Université Examinateur
Frédéric de Limoges

M. BURET François Professeur – Ecole Centrale de Lyon Directeur de
thèse

Sommaire

Glossaire et abréviation
………………………………………………………………………… 5

Introduction
……………………………………………………………………………………………………… 9

Chapitre I. Marquage magnétique et micromanipulation
de cellules: Etat l’Art

Introduction ............................................................................................................. 21
Partie I : Les nanoparticules magnétiques : propriétés et applications en biologie
et en médecine ........................................................................................................ 23
1.1 Structure des nanoparticules magnétiques : .................................................. 25
1.2 Propriétés magnétiques : ............................................................................... 27
1.3 Exemples d’applications des nanoparticules en biologie et en médecine : .. 28
1.3.1 Imagerie par Résonnance Magnétique ......................................................... 29
1.3.2 Hyperthermie ................................................................................................ 30
1.3.3 Séparation et tri de cellules .......................................................................... 31
1.4 Conclusion : .................................................................................................. 34
Partie II : Techniques de marquage magnétique des cellules .................................. 37
2.1 Marquage magnétique : à l’intérieur du cytoplasme .................................... 40
2.1.1 Endocytose .................................................................................................... 40
2.1.2 Lipofection .................................................................................................... 45
2.1.3 Magnétofection ............................................................................................. 47
2.2 Immunomarquage magnétique : à la surface de la cellule ............................ 49
2.2.1 Anticorps ...................................................................................................... 50
2.2.2 Différentes stratégies d’immunomarquage magnétique : ............................. 51
2.3 Conclusion .................................................................................................... 54
Partie III : Manipulation de cellules par magnétophorèse ....................................... 56
3.1 La susceptibilité magnétique ........................................................................ 59
3.2 La force magnétique ..................................................................................... 60
3.3 Systèmes miniaturisés pour la séparation magnétique ................................. 62
3.3.1 L’intérêt de la réduction d’échelle .................................................................. 63
3.3.2 Les sources magnétiques en microfluidique ................................................... 66
3.3.3 Microsystèmes magnétiques pour le tri cellulaire .......................................... 69
3.4 Conclusion ..................................................................................................... 75
Références bibliographiques ................................................................................. 77

Chapitre II. Les micro-aimants et leur emploi pour le
suivi de l’internalisation cellulaire de nanoparticule par
endocytose

Introduction ............................................................................................................. 97
I. Conception et fabrication des micro-aimants. .............................................. 99
1.1 Dépôt du film magnétique ............................................................................ 99
1.2 Structuration magnétique des films de NdFeB ........................................... 100
II. Attraction d’objets magnétiques à la surface des micro-aimants : ............. 103
2.1 Nanoparticules superparamagnétiques ....................................................... 103
2.2 Vésicules unilamellaires géantes encapsulant des nanoparticules.............. 104
2.3 Cellules eucaryotes marquées magnétiquement ......................................... 106
III. Utilisation des micro-aimants comme outil pour étudier la cinétique
d’endocytose. ........................................................................................................ 110
3.1 Etude de l’internalisation en fonction de la quantité de nanoparticules
présentent dans le milieu d’incubation. ................................................................ 111
3.2 Etude de l’internalisation en fonction du temps d’incubation : .................. 112
3.3 Etude de l’internalisation en fonction de la charge à la surface des
nanoparticules ....................................................................................................... 115
IV. Etude de l’endocytose chez deux différentes populations de cellules. ....... 118
Discussion .............................................................................................................. 121
Conclusion et perspectives .................................................................................... 126
Références bibliographiques ............................................................................... 128

Chapitre III. Tri de cellules sur réseau de micro-aimants
intégré en circuit microfluidique

Introduction ........................................................................................................... 142
I. Marquage magnétique et tests d’attraction des cellules. ............................ 144
1.1 Double marquage magnétique et fluorescent : ........................................... 144
1.2 Comportement des cellules à la surface du réseau de micro-aimants : ...... 146
II. Optimisation du protocole de marquage immunomagnétique .................... 146
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III. Processus d’intégration des réseaux de micro-aimants dans un circuit
microfluidique. ..................................................................................................... 148
3.1 Intégration des micro-aimants dans un canal microfluidique. .................... 148
3.1.1 Fabrication du micro-canal. ........................................................................ 150
3.1.2 Dépôt de la fine couche. ............................................................................. 150
3.1.3 Collage du micro-canal sur la fine couche. ................................................ 151
3.2 Influence de l’épaisseur de la fine couche de PDMS sur l’attraction
magnétique. ........................................................................................................... 152
3.3 Étude de la capacité d’attraction du micro-trieur ....................................... 154
IV. Application à la séparation magnétique des cellules. ................................. 155
4.1 Séparation de cellules à l’aide du micro-trieur magnétique. ...................... 155
4.2 Quantification des cellules par cytométrie en flux. .................................... 157
4. 3 Caractéristiques microfluidiques. ............................................................... 160
Discussion .............................................................................................................. 163
Conclusion et perspectives .................................................................................... 168
Références bibliographiques ............................................................................... 170

Conclusion générale et perspectives
…………………………………..177

Annexes
………………………………………………………………………………………………….…….....185

Liste de publications
…………………………………………………………………….………195

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Glossaire et abréviation

ADN: Acide Désoxyribonucléique
ARN: Acide Ribonucléique
BSA: Bovine Serum Albumin
CMFDA: 5-chloromethylfluorescein diacetate
CMTMR: 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)
CTCs: Cellules Tumorales Circulantes
DEAE: Diethylaminoethyl MNPs : Magnetic Nanoparticles
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
DOPC: 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine
DOTMA: {N-[1-(2,3,-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride}
FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter
Fab: fragment antigen binding
Fc: fragment cristallisable
Gd++: Ions Gadolinium
GUV: vésicules unilamellaires géantes
HEK 293: Humain Embryonic Kidney
HeLa: Lignée de cellules cancéreuses (cancer du col de l'utérus) provenant
d’Henrietta Lacks.
Ig: Immunoglobuline
IRM: Imagerie par Résonnance Magnétique
MACS: Magnetic Activated Cell Sorter
MET: Microscopie Electronique a Transmission
MOIF: Magneto-Optical Indicator Film
m/m: concentration massique
µTAS: Micro Total Analysis System
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NBD-PE: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3 phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3
benzoxadiazol-4-yl
NdFeB: Néodym-Fer-Bore, matériaux d’aimant permanent)
PCR: Polymerase Chain Reaction
PDMS: PolyDiMéthylSiloxane
PEG: polyéthylène glycol
RMN: Résonnance Magnétique Nucléaire
ROS: Reactive Oxygen Species
SHPM: microscopie à sonde de Hall
SPION: SuperParamagnetic Iron Oxide Nanoparticle
TMP: Thermomagnetic patterning
USPION: Ultra-Small Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticle
UV: Ultra Violet
VSM: magnétométrie à échantillon vibrant
WGA: Wheat Germ Agglutinin

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