atividade antiviral e imunomoduladora de extratos originados de uncaria sp. em infecção in vitro ...

139 Pages·2016·2.62 MB·Portuguese

MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Mestrado pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ATIVIDADE ANTIVIRAL E IMUNOMODULADORA DE EXTRATOS
ORIGINADOS DE UNCARIA SP. EM INFECÇÃO IN VITRO DE
LINHAGEM CONTÍNUA DE HEPATÓCITOS HUMANOS PELO VÍRUS
DENGUE

CÍNTIA DA SILVA MELLO

Rio de Janeiro
Fevereiro de 2015
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

CÍNTIA DA SILVA MELLO

Atividade antiviral e imunomoduladora de extratos originados de Uncaria sp.
em infecção in vitro de linhagem contínua de hepatócitos humanos pelo vírus
Dengue

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo
Cruz como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Ciências.

Orientadora: Dra. Claire Fernandes Kubelka.

RIO DE JANEIRO
Fevereiro de 2015

ii
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

AUTORA: CÍNTIA DA SILVA MELLO

ATIVIDADE ANTIVIRAL E IMUNOMODULADORA DE EXTRATOS ORIGINADOS
DE UNCARIA SP. EM INFECÇÃO IN VITRO DE LINHAGEM CONTÍNUA DE
HEPATÓCITOS HUMANOS PELO VÍRUS DENGUE

ORIENTADORA: Dra. Claire Fernandes Kubelka.
Aprovada em: 24 / 02 / 2015.
EXAMINADORES:
Prof. Dra. Carmen Penido Monteiro – Presidente.
Prof. Dra. Luciana Barros de Arruda.
Prof. Dra. Andrea Henrique Pons.
Prof. Dra. Iranaia Assunção Miranda.
Prof. Dra. Patrícia Cristina Neves.

Rio de Janeiro, 24 de Fevereiro de 2015.

iv
Anexar a cópia da Ata que será entregue pela SEAC já assinada.

v
Dedico este trabalho à minha Mãe Sônia in memorian,
minha “borboleta-guia”, meu anjo, minha inspiração.
À Sra., todo meu amor e saudade.
Te amo hoje, amanhã e sempre.

vi
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por tudo o que tens feito, por tudo que vais fazer. Por
tuas promessas e tudo que És. O Dono do meu ser, meu Senhor e Salvador;
À Dra. Claire Kubelka, por ter depositado confiança na minha trajetória.
Obrigada por todos os anos de sabedoria e amizade que me foram proporcionados.
Obrigada por ser meu exemplo de profissional e excelência. Sentirei saudades;
À Dra. Sônia Regina Nogueira Ignácio Reis e à Técnica Maryrose Lavatori
(FIOCRUZ), pelos primeiros ensinamentos. Obrigada pela paciência e palavras de
incentivo;
Ao Dr. Raimundo Sousa Lima Júnior, o qual foi meu co-orientador na época
da iniciação científica e, mais que isso, um grande amigo de trabalho. Obrigada pela
parceria e conhecimentos compartilhados;
Aos pesquisadores Ligia Marinho Valente (UFRJ), e Antonio Carlos Siani
(Far-Manquinhos – FIOCRUZ) pela parceria e concessão dos extratos utilizados
neste trabalho;
Às Doutoras que aceitaram o convite da leitura deste projeto, sugerindo
melhorias, de forma a aperfeiçoar o mesmo. Sobretudo, à Dra. Carmem Penido pelo
belíssimo trabalho de revisão;
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária do Instituto Oswaldo
Cruz;
Ao CNPq, a FAPERJ e ao PDTIS pelo apoio financeiro;
À minha tão amada Mãe Sônia in memorian, por todos os seus ensinamentos
e dedicação. Àquela que me amava incondicionalmente, e tudo fez para criar a mim
e ao meu Irmão Igor. Obrigada por me ensinar a ser uma mulher guerreira e
determinada. Meus caminhos hoje se resumem em te orgulhar. Amo-te eternamente;
Aos meus avós Josefa in memorian e Luiz, por serem meus ícones de amor,
bondade e família. Meu vovô, que tanto acredita nos meus sonhos e torce pela
minha felicidade, Obrigada por tudo, te amo demais;
Aos meus tios Maria da Conceição e Cláudio, por todo carinho, apoio e amor.
Pessoas fundamentais em minha vida, exemplos de garra e superação. Amo vocês;
Ao meu irmão Igor, por todos as alegrias, briguinhas e por torcer pelo meu
sucesso. Às minhas primas-irmãs Tatiana e Talita, por serem tão amigas e
confidentes. Amo vocês, meus lindos;
vii
Ao meu namorado Thiago, por todo apoio, amor, carinho e compreensão.
Você me faz muito feliz. Obrigada por ser meu companheiro de alegrias e tristezas.
Te amo, Amore;
À minha Grande Família, que mesmo com tantas atribulações permanece
unida e forte. Obrigada a cada um;
À minha sogra Eliete, por ser tão generosa e amiga. Por me apoiar como mãe
e torcer pela minha felicidade. Obrigada por ser tão especial;
À minha "gêmula" Jéssica por ser uma amiga tão leal e indispensável em
todos os momentos da minha vida. Te amo;
À toda família do Laboratório de Imunologia Viral, especialmente, a todos os
companheiros da B120, por fazerem meus dias mais divertidos. Minhas pedras
preciosas;
A todos que de alguma maneira me ajudaram na caminhada até este
momento.

viii
“Tudo posso naquEle que me fortalece”.
Filipenses 4:13.

ix
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ATIVIDADE ANTIVIRAL E IMUNOMODULADORA DE EXTRATOS ORIGINADOS DE UNCARIA SP.
EM INFECÇÃO IN VITRO DE LINHAGEM CONTÍNUA DE HEPATÓCITOS HUMANOS PELO VÍRUS
DENGUE

RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Cíntia da Silva Mello
A incidência de dengue em todo o mundo tem aumentado nas últimas décadas. As
respostas imunológicas exacerbadas desempenham um papel crucial para a sua
fisiopatologia, tais como a indução do extravasamento plasmático, originado principalmente
pela produção de uma cascata de citocinas inflamatórias e que podem induzir distúrbios de
coagulação e alteração da permeabilidade vascular levando, eventualmente, a hemorragias
graves e ao choque. Os produtos naturais, que têm propriedades imunomoduladoras
descritas na etnofarmacologia, podem promover o controle da replicação viral e uma
redução de citocinas que induzem a permeabilidade endotelial, o que poderia resultar em
manifestações clínicas mais leves. O objetivo deste estudo foi investigar se compostos
provenientes de uma planta medicinal poderiam modular a resposta imune inata associada
com características imunopatológicas na infecção pelo vírus Dengue (DENV), usando um
modelo de infecção in vitro com linhagens contínuas de hepatócitos humanos (Huh-7).
Métodos e Resultados: Após infecção das células-alvo Huh-7 pelo DENV-2, as culturas
foram tratadas com lotes únicos de extratos hidroalcoólicos de Uncaria sp. (UGC ou UGF),
em diferentes concentrações. A taxa de células contendo antígenos virais foi determinada
após períodos de incubação por imunofluorescência vírus específica e citometria de fluxo. A
proteína viral não estrutural (NS1), indicativa de replicação viral, foi detectada nos
sobrenadantes de cultura de células assim como as citocinas/quimiocinas MIF, IL-8 e IL-6,
todas determinadas por ensaios de ELISA. Nos mesmos sobrenadantes, a produção do
fator inflamatório óxido nítrico foi determinada indiretamente pela detecção de nitrito
(Reação de Griess). Além disso, foram observados por citometria de fluxo alterações de
viabilidade celular, apoptose e necrose, utilizando marcações pelo kit LIVE/DEAD e por
Anexina V e Iodeto de propídio (PI). Foram observados efeitos antivirais de UGC e UGF,
estatisticamente significantes, em comparação com células não tratadas, em concentrações
que reduziram a frequência de células positivas para o antígeno viral e a quantidade de NS1
secretada. Efeitos imunomoduladores significantes foram mostrados pela redução da
secreção de MIF, IL-8 e IL-6. Houve um aumento na produção de nitrito em culturas
infectadas e tratadas com os dois extratos em diferentes concentrações, além de redução
das taxas de apoptose e necrose, significantes. Conclusão: Existem compostos ativos na
espécie vegetal que possuem capacidades antiviral e imunomoduladora. Sendo assim,
mostraram-se potenciais candidatos para o desenvolvimento de um produto para tratamento
da dengue. Apoiado por FIOCRUZ / RPT11D; IOC / PROEP; CNPq; FAPERJ; CAPES.
x