ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)

113 Pages·2007·1.51 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL

ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO
SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)
MACHOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

Welber Daniel Zanetti Lopes
Médico Veterinário

JABOTICABAL, SP – BRASIL - 2007
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL

ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO
SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)
MACHOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

Welber Daniel Zanetti Lopes

Prof. Dr. Alvimar José da Costa
Orientador

Dissertação apresentada à Facul-
dade de Ciências Agrárias e
Veterinárias - UNESP, Campus de

Jaboticabal, como parte das

exigências para a obtenção do título
de Mestre em Medicina Veterinária
(Medicina Veterinária Preventiva).

JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
Janeiro de 2007
Trabalho realizado no “Centro de
Pesquisas em Sanidade Animal-
CPPAR/FCAV/UNESP, no departamento
de Medicina Veterinária Preventiva da
FCAV-UNESP, no Instituto Adolfo Lutz e no
Laboratório de prozoologia molecular da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
SUMÁRIO

Página

LISTA DE TABELAS......................................................................................................... iv
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... vii
RESUMO.......................................................................................................................... 01
SUMMARY....................................................................................................................... 02
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................. 03
1.1. Aspectos Gerais................................................................................................... 03
1.2 Toxoplasmose em ovinos...................................................................................... 07
2. OBJETIVOS.................................................................................................................. 15
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 16
3.1. Cepas de Toxoplasma gondii............................................................................... 16

3.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoítos de T. gondii.......................... 16
3.3. Obtenção de oocistos de Toxoplasma gondii...................................................... 17
3.4. Obtenção de taquizoítos de Toxoplasma gondii.................................................. 19
3.5 Confecção de lâminas com antígeno para IFI.................................................... 19
3.6. Seleção e adaptação dos ovinos reprodutores para o experimento.................... 20
3.7 Condicionamento dos reprodutores ovinos à colheita de sêmen.......................... 21
3.8 Inoculação dos ovinos reprodutores machos........................................................ 21
3.9. Exames clínicos................................................................................................... 23
3.10. Determinação de parasitemia............................................................................ 23
3.11. Resposta imune humoral (IFI)......................................................................... 24
3.12. Exames no sistema reprodutor dos ovinos infectados experimentalmente ...... 25
3.12.1. Colheita do sêmen.................................................................................... 25
3.12.2. Parâmetros espermáticos......................................................................... 25

3.12.2.1 Motilidade e vigor.................................................................................... 25
3.12.2.2 Concentração e volume.......................................................................... 25
3.12.2.3 Morfologia espermática.......................................................................... 26
3.13. Bioensaio em camundongos................................................................................... 26
3.14 Pesquisa de DNA de T. gondii pela PCR................................................................. 26
3.14.1. Extração do DNA das amostras do controle positivo e das amostras de
27
sêmen.......................................................................................................
3.14.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)................................................. 28
3.14.3. Eletroforese em gel de agarose para análise dos produtos amplificados
29
na PCR.....................................................................................................
3.15. Pesquisa do Toxoplasma gondii no testículo, vesícula seminal, próstata e
29
epidídimo dos ovinos reprodutores.........................................................................
3.15.1. Exames anátomo-histopatológicos nos órgãos reprodutores dos
29
ovinos..........................................................................................
3.15.2. Bioensaio em camundongos........................................................... 30
3.15.3. Imunoistoquímica em órgãos do sistema reprodutor dos ovinos.. 31
3.15.4 Pesquisa do DNA de T. gondii em tecidos pela PCR...................... 33
4. ANÁLISE ESTATÍSTICAS............................................................................................ 34
5. RESULTADOS............................................................................................................. 35

5.1. Obtenção de taquizoítos de T. gondii.................................................................. 35
5.2. Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoítos de T.gondii......................... 35
5.3. Obtenção de oocistos de T.gondii....................................................................... 35
5.4. Seleção dos ovinos reprodutores........................................................................ 36
5.5. Exames clínicos................................................................................................... 37
5.5.1 Temperatura corporal........................................................................ 37
5.5.2 Freqüência cardíaca.......................................................................... 39
5.5.3 Freqüência respiratória..................................................................... 41
5.5.4 Outros sinais clínicos........................................................................ 43
5.6 Exames nos sistema reprodutor dos ovinos infectados experimentalmente........ 45
5.6.1 Parâmetros espermáticos................................................................. 45
5.7. Determinação de Parasitemia............................................................................ 53
5.8. Resposta Imune Humoral..(RIFI)......................................................................... 55
5.9. Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos (Bioprova)..................... 58
5.10. Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos pela PCR.................... 61
5.11. Exames anátomo-histopatológicos (necropsias)................................................ 62
5.12 Exames histopatológicos.................................................................................... 62
5.13. Pesquisa do Toxoplasma gondii em tecidos dos reprodutores ovinos............... 62
5.13.1. Bioprova..................................................................................................... 62
5.13.2. Imunoistoquímica....................................................................................... 62
5.13.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).................................................. 65
6. DISCUSSÃO................................................................................................................. 66
7. CONCLUSÕES............................................................................................................. 73
6. REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 74
LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1. Infecção toxoplásmica em ovinos pertencentes a diversas
09
regiões Mundiais......................................................................................

Tabela 2. Delineamento experimental dos oito ovinos reprodutores
22
submetidos à infecção toxoplásmica experimental..................................

Tabela 3. Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)..........
29

Tabela 4. Resultados sorológicos para Toxoplasmose, Neosporose,
Brucelose e Leptospirose dos ovinos examinados para seleção dos
36
grupos experimentais infectados com Toxoplasma gondii......................
Tabela 5. Temperatura retal média mensurada dos ovinos
experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma
38
gondii........................................................................................................

Tabela 6. Freqüência cardíaca média mensurada nos ovinos
experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma
40
gondii........................................................................................................

Tabela 7. Freqüência respiratória média mensurada nos ovinos
experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma
42
gondii........................................................................................................

Tabela 8. Parâmetros seminais de ovinos inoculados com oocistos de
46
Toxoplasma gondii...................................................................................

Tabela 9. Parâmetros seminais de ovinos inoculados com taquizoítos
47
de Toxoplasma gondii..............................................................................

Tabela 10. Parâmetros seminais de ovinos pertencentes ao grupo
48
Controle....................................................................................................

Tabela 11. Comparações múltiplas e resultados da análise de
variância dos parâmetros seminais de ovinos nos não inoculados
(controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106
49
taquizoítos de Toxoplasma gondii............................................................

Tabela 12. Surtos parasitêmicos detectados em ovinos não infectados
(controle) e inoculados com Toxoplasma
54
gondii........................................................................................................
Tabela 13. Recíproca dos títulos obtidos pela Reação de
Inumofluorescência Indireta (IFI) em ovinos não inoculados (controle) e
inoculados com 2,5 x 105 ou com 1,0 x 106
56
taquizoítos................................................................................................

Tabela 14. Comparações múltiplas e resultados da análise de
variância do título sorológico de ovinos nos não inoculados (controle) e
inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos de
57
Toxoplasma gondii...................................................................................

Tabela 15. Pesquisa de T. gondii em camundongos inoculados com
amostras seminais oriundas dos reprodutores ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com oocistos ou
60
taquizoítos...............................................................................................

Tabela 16. Parasitismo tissular detectado pela técnica de
imunoistoquímica em testículos, epidídimos vesícula seminal e
próstata de ovinos inoculados com 2 x 10 5 oocistos ou 1 x 10 6
63
taquizoítos de Toxoplasma gondii............................................................
LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1. Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x
39
105 oocistos de Toxoplasma gondii................................................................

Figura 2. Freqüências cardíacas médias mensuradas nos ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x
41
105 oocistos de Toxoplasma gondii................................................................

Figura 3. Freqüências respiratórias médias mensuradas nos ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x
43
105 oocistos de Toxoplasma gondii...............................................................