Aplicación de técnicas moleculares basadas en ADN y ARN

321 Pages·2007·11.74 MB·Spanish

by  Juan Gonzalez

Índice
I
Capítulo 1: Introducción 1

1.1 Diversidad microbiana y técnicas de estudio 1
1.1.1 Diversidad microbiana 1
1.1.2 Bacteria y Archaea 4
1.1.3 Diversidad y distribución de los microorganismos 7
1.1.4 Métodos para el estudio de las comunidades
8
microbianas
1.1.4.1 Cultivos 8
1.1.4.2 Técnicas moleculares 11
1.2 Antecedentes de estudios en la cueva de Altamira 15
1.3 Microbiología de la cueva de Altamira y otras
19
cuevas
1.4 Hipótesis de trabajo 23
1.5 Objetivos 24

Capítulo 2: Materiales y Métodos
25

2.1 Descripción de la cueva de Altamira 25
2.1.1 La cueva de Altamira: descubrimiento e historia 25
2.1.2 Geología del entorno de la cavidad y características
31
kársticas
2.1.3 Sistema fisicoquímico de la cueva 32
2.2 Muestreo 35
2.2.1 Puntos de muestreo 35
2.2.1.1 Colonizaciones blancas 36
2.2.1.2 Colonizaciones amarillas 36
2.2.1.3 Colonizaciones grises 40
2.2.1.4 Moonmilk 40
2.2.1.5 Suelo 41
2.2.1.6 Colonizaciones verdes 41
2.2.1.7 Agua de infiltración 44
2.2.1.8 Leopard spots 44
2.2.1.9 Biocidas 46
2.2.2 Recogida y tratamiento de las muestras 46
2.3 Detección de microorganismos a partir de sus
47
ácidos nucleicos
2.3.1 Extracción de ADN 47
2.3.2 Extracción de ARN 49
2.3.3 Amplificación de genes de ARNr 49
2.3.4 Amplificación de muestras difíciles: MDA-PCR 51
2.3.5 Geles de agarosa 54
2.3.6 Electroforesis en geles de poliacrilamida con
55
gradiente químico (DGGE)
2.3.7 Análisis cuantitativo por PCR-DGGE 58
2.3.8 Comparación de los perfiles moleculares obtenidos
59
por DGGE
2.3.9 Purificación de productos de PCR 61
2.3.10 Construcción de genotecas 61
2.3.11 Selección de clones 64
2.3.12 Extracción de plásmidos 65
2.3.13 Secuenciación de ADN 65
2.3.14 Bioinformática y procesamiento de secuencias 65
2.3.15 Cobertura de comunidades naturales por clones
67
secuenciados
2.4 Cultivos 69
2.4.1 Inoculaciones y caracterización de cultivos 69
2.5 Soluciones y Tampones 71
2.5.1 Solución EDTA 0.5M, pH 8,0 71
2.5.2 Tris-HCl 1M pH 7.5 72
II
2.5.3 Tris-HCl 1M pH 8.2 72
2.5.4 Tampón TAE 50x (Tris-Acetato-EDTA) 72
2.5.5 Tampón de carga para DGGE 72
2.5.6 Tampón de carga para electroforesis en gel de
72
agarosa
2.5.7 Solución 0% de desnaturalizante para DGGE 73
2.5.8 Solución 80% de desnaturalizante para DGGE 73
2.5.9 Solución alcalina de lisis 73
2.5.10 Solución de neutralización 73
2.6 Medios de cultivo 73
2.6.1 Medio LB (Luria-Bertani) 73
2.6.2 Medio MA (Malta-Agar) 74
2.6.3 Medio TSA (“Trypticase-Soy-Agar”) 74
2.6.4 Medio 63 75
2.6.5 Medio MT 76

Capítulo 3: Resultados
79

3.1 Análisis preliminares para la comparación de
perfiles moleculares 80
3.2 Comparaciones entre perfiles moleculares 83
3.2.1 Comparación entre perfiles basados en ADN y ARN 83
3.2.2 Comparación de perfiles moleculares de muestras
del mismo tipo 86
3.2.3 Comparación de perfiles moleculares de distintos
tipos de muestras 93
3.3 Afiliación taxonómica de las secuencias
94
obtenidas
3.4 Microorganismos presentes en las muestras 95
estudiadas
3.4.1 Colonizaciones blancas 95
3.4.1.1 Análisis de las genotecas 95
3.4.1.2 Análisis densitométricos 100
3.4.1.3 Comparación de los resultados obtenidos
mediante análisis de genotecas y densitométricos 107
3.4.1.4 Cultivos 108
3.4.2 Colonizaciones amarillas 111
3.4.2.1 Análisis de las genotecas 111
3.4.2.2 Análisis densitométricos 113
3.4.2.3 Comparación de los resultados obtenidos
mediante análisis de genotecas y densitométricos 118
3.4.3 Colonizaciones grises 120
3.4.3.1 Análisis de las genotecas 120
3.4.3.2 Análisis densitométricos 122
3.4.3.3 Comparación de los resultados obtenidos
mediante análisis de genotecas y densitométricos 127
3.4.4 Depósitos de moonmilk 139
3.4.4.1 Análisis de las genotecas 129
3.4.4.2 Análisis densitométricos 132
3.4.4.3 Comparación de los resultados obtenidos
mediante análisis de genotecas y densitométricos 132
3.4.5 Muestras de Suelo 136
3.4.5.1 Suelo interior 136
3.4.5.2 Suelo exterior 138
3.4.5.3 Cultivos a partir de muestras de suelo 138
3.4.6 Colonizaciones verdes 140
3.4.7 Formaciones Leopard spots 144
3.4.8 Agua de goteo o de infiltración 146
3.4.9 Zona tratada con biocidas 146

IV
3.5 Análisis global de los resultados obtenidos para 146
la cueva de Altamira
3.5.1 Curvas de cobertura 148
3.5.2 Grupos bacterianos más representativos 148
3.6 Análisis de grupos específicos de
microorganismos en la cueva de Altamira 159
3.6.1 Bacterias reductoras de sulfato 159
3.6.2 Crenarchaeota de baja temperatura 163
3.6.3 Microorganismos fototrofos 166
3.6.4 Eucariotas heterótrofos 166
3.7 Resultados de los nuevos métodos empleados:
167
MDA-PCR

Capítulo 4: Discusión 173

4.1 Caracterización de las principales colonizaciones
179
y muestras de la cueva de Altamira
4.1.1 Colonizaciones Blancas 181
4.1.2 Colonizaciones amarillas 182
4.1.3 Colonizaciones grises 185
4.1.4 Depósitos de Moonmilk 186
4.1.5 Suelo 188
4.1.6 Colonizaciones verdes 190
4.1.7 Formaciones Leopard spots 192
4.1.8 Agua de infiltración 192
4.1.9 Zona tratada con biocidas 193
4.2 Análisis de grupos específicos detectados en la 194
cueva de Altamira
4.2.1 Acidobacteria 195
4.2.2 Actinobacteria 199
4.2.3 Bacteroidetes 201
4.2.4 Chloroflexi 201
4.2.5 Firmicutes 202
4.2.6 Nitrospirae 204
4.2.7 Plantomycetes 205
4.2.8 Proteobacteria 206
4.2.9 Verrucomicrobia 210
4.2.10 Crenarchaeota 211
4.2.11 Bacterias Reductoras de Sulfato 213
4.2.12 Microorganismos anaerobios 216
4.2.13 Microorganismos fototrofos 218
4.2.14 Eucariotas heterótrofos 219
4.3 Estimación de la diversidad total en la cueva de 221
Altamira
4.4 Otros métodos moleculares empleados 224
4.4.1 MDA-PCR 224

Capítulo 5: Conclusiones
229

Bibliografía 233

Apéndice 267
Tabla 1 268
Tabla 2 299
Tabla 3 300
Tabla 4 301
Tabla 5 302
Tabla 6 310
VI

Capítulo 1: Introducción

1.1 Diversidad microbiana y técnicas de estudio

1.1.1 Diversidad microbiana

En los ecosistemas naturales conviven una gran diversidad de
microorganismos (Pace, 1997; Delong, 2001). Hoy en día, se ha
comprobado que los microorganismos desempeñan funciones
esenciales y participan activamente en las cadenas tróficas y ciclos
biogeoquímicos de los elementos (Pace et al., 1997; Whitman et al.,
1998).

A lo largo de unos 3500-4000 millones de años los
microorganismos han sido capaces de colonizar todo el planeta
(Madigan et al., 2000) especializándose y diversificándose en función
del ambiente que ocupan. Ello les ha llevado a desarrollar un amplio
espectro de metabolismos diferentes. Además, los microorganismos
son extremadamente abundantes. Por ejemplo, se calcula que un
gramo de suelo puede albergar más de 108-109 microorganismos
(Ashelford et al., 2003). Por tanto, se hace necesario conocer y
1
analizar estas comunidades microbianas. De este modo podemos
comprender su función y relación con otros componentes del sistema,
pues, además de las características propias de cada microorganismo,
han de tenerse en cuenta las interacciones que tienen lugar entre los
componentes de una comunidad.

Las comunidades microbianas naturales resultan complejas y
difíciles de estudiar debido, principalmente, al pequeño tamaño de los
microorganismos y a la elevada diversidad que presentan microbiana
que presentan.

En los primeros años de la Microbiología, los
microorganismos se empezaron a clasificar en base a sus
características morfológicas. Este sistema de clasificación era
generalmente aceptado para organismos superiores que muestran
diversidad morfológica. Sin embargo, en el caso de los
microorganismos, la morfología bacteriana y otras características
fenotípicas no son suficientes para una clasificación adecuada (Stainer
y van Niel, 1962). Por otro lado, el concepto de especie es muy
controvertido en Microbiología y se está intentando adaptarlo al
desarrollo de nuevas técnicas de análisis, fundamentalmente basadas
en características genéticas (Roselló-Mora y Amann, 2001;
Stackebrandt et al., 2002).

En la actualidad, teniendo en cuenta el número de seres vivos
adecuadamente descritos, la mayor parte de las especies catalogadas
pertenecen al Reino Animal, fundamentalmente insectos, mientras que
sólo alrededor del 10% del número total de organismos vivos
descritos serían microorganismos. Sin embargo, observando un árbol
filogenético de las formas vivientes conocidas (Figura 1.1), se puede
comprobar que todos los organismos pluricelulares (animales y
plantas incluidos), quedarían reducidos sólo a un par de las ramas
finales dentro del dominio Eukarya.
2