Aplicación de la técnica PCR

399 Pages·2000·24.94 MB·Spanish

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL 1
APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR
(REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA)
EN EL DIAGNÓSTICO Y EPIDEMIOLOGÍA DE
LA TUBERCULOSIS EN ANIMALES
ALICIA ARANAZ MARTÍN
Memoria presentada para optar al
título de Doctor en Veterinaria
Madrid, 1996
D. LUCAS DOMÍNGUEZ RODRÍGUEZ, D. GUILLERMO SUÁREZ FERNÁNDEZ Y
DÑA. ANA MATEOS GARCÍA, CATEDRÁTICOS Y PROFESORA TITULAR DE
MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA
ANIMAL 1 (SANIDAD ANIMAL) DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,
CERTIFICAN:
Que esta tesis ha sido realizada por Miela Aranaz Martín en el Departamento de
Patología Animal 1 (Sanidad Animal) de la Facultad de Veterinaria de la Universidad
Complutense de Madrid bajo nuestra dirección.
Lucas Domínguez Rodríguez Guillermo Suárez Fernández Ana Mateos García
Durante la realización de estos trabajos, he tenido la suerte de encontrar en el camino
buena gente que ha compartido conmigo mucho tiempo y trabajo, y a la que hoy desearía
expresar mi más sincera gratitud,
A mis directores, D. Lucas Domínguez, Dña. Ana Mateos, y D. Guillermo Suarez por
su carácter emprendedor, y por la paciencia y el apoyo en la realización de esta tesis. A
Lucas, su contagiosoentusiasmo y optimismo, su botella (más bien garrafa) totalmente llena,
frente a mi botella (más bien sólo vaso) casi vacía. A Ana y a D. Guillermo, el gran inter¿s
para que esta tesis saliera adelante y la esmerada revisión del manuscrito.
A Ernesto Liébana, compañero de fatigas, por las miles de horas currando juntos, y
las miles de peleas, casi todas ellas fmctíferas y por lo menos, animadas.
A mis compañeros, por sus ánimos constantes y su contagiosa alegría, y muy
especialmentea Mayte, Mar, Gustavo, Alicia, Louie y Cristina,porsu comprensión y amistad
día a día.
Al Dr. Enrique Gómez-Mampaso, sin cuya ayuda nunca habríamos empezado este
trabajo, por todo lo que afectuosamente nos enseñó y porque tiene toda la razón eso de “la
vida es el arte de lo posible”.
A Debby Cousins su ayuda y consejos, y a Suzette Williams y Harry Francis
(Australian Reference Laboratory for Bovine Tuberculosis, Agriculture, Western Australia)
su colaboración.
A J.C. Tercero (Pharma Gen, S.A.) su apoyo en las fases iniciales de este trabajo.
A M. Domingo y D. Vidal (Histología y AnatomíaPatológica, Facultad de Veterinaria
de la U.A.B.), Ji!. Urqula (Comunidad Autónoma de Madrid), ¿EM. Cámara (Ayuntamiento
de Madrid), C. Novoa, X. Pickering yE. Merlo (Patología AnimalII, Facultad de Veterinaria
de la U.C.M.), M. Hermoso, J. Hermoso y A. Tato (Patología Infecciosa, Facultad de
Veterinaria, Universidad de Extremadura), M. Hernández(Instituto para laConservación de
la Naturaleza, Madrid), A. Ramis (Patología, Facultad de Veterinaria de la U.A.E.), 3.
1~~
Fernández (Zoo de Barcelona) y Celia Sánchez (Parque Nacional de Doñana, Huelva). el
envío de las muestras.
A O. González y E.F. Rodríguez-Perú (Patología Animal, Facultad de Veterinaria de
León) el préstamo de las cepas de León y la completa información sobre las granjas.
A E. Gómez-Mampaso y J. Blázquez (Servicio de Microbiología, Hospital Ramón y
Cajal de Madrid) la cesión de las cepas humanas.
A C. Pascual y D.M. Collins (Institute of Food Research, Reading Laboratory) la
secuenciación e identificación del ADN del M. genavense
Al grupo de la Unit Molecular Microbiology y Laboratory of Bacteriology (National
Institute of Public Health and Environmental Protection, Bilthoven, Holanda) el suministro
de las membranas de DVR-.spoligotyping.
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (Programa
de Formación de Personal Investigador), el projecto MR PL 920697 de la Unión Europea;
el proyecto 92/0251 del Fondo de Investigaciones Sanitarias, el Proyecto l+D 0030/94 de la
C.A.M. y por la Australian Bovine Brucellosis and Tuberculosis Eradication Campaign.
A José Carlos
ÍNDICE
1. INTRODUCCION 1
1. ANTECEDENTESHISTÓRICOS 3
.1. La tuberculosisenlaantigúedad 3
1.2.La tuberculosis en Europadesdela EdadMedia alsiglo XVIII 4
1.3. El descubrimiento de Koch 8
1.4. La tubemulina 11
1.5. La vacuna BCG 12
1.6. La quimioterapia 13
2.CARACTERÍSTICASGENERALESDELAS MICOBACTERIAS 15
2.1. Encuadre taxonómicodelgéneroMycobacterium 15
2.2. Clasificación de las micobacterias 17
2.3. Característicascinicasy tratamiento 19
2.4. Deteccióneidentificacióndemicobacterias 23
2.4.1. Microscopia directa 24
2.4.2. Cultivo eidentificación tradicionales 24
2.5. Nuevosmétodosdecultivo eidentificación 29
2.5.1. Sistemas de detecciónradiométrica 29
2.5.2. Cromatografíalíquidade altaresolución 30
2.5.2. Sondasde ácidos nucleicos 30
2.5.3. Reacción encadenade lapolimerasa(PCR 31
3.COMPLEJOM. tuberculosis 39
3.1. Al. tuberculosis 40
3 2 M bovis 42
3.3. M. africanum 43
3 4 Al bovis BCG 43
35 Al. ¡nicrod 44
3 6 Micobacteñaaislada de loshyrax (Dassie bacillus) 44
3.7. Micobacteria aislada delas focas (Sealbacillus) 45
4. COMPLEJO M. avium-intracelluki,re 47
5. PATOGÉNESIS 51
5.1. Rutas de infección 52
5.1.1. Excreción de Al. bovis 54
5.1.2. SupervivenciadeAl. bovisen el medio 55
5.2. La respuesta inmune 55
5.2.1. El papel delosfagocitosmononucleares 57
5.2.2. Mecanismos microbicidasde los ¡nacrófagos 58
5.2.3. Citoquinas producidasporlosmacrófagos 63
5.2.4. Reconocimientodel antígenoporlos linfocitosT 66
5.2.5. Antígenosdelasmicobacteriasreconocidosporlos linfocitosT 66
5.2.6. Los linfocitosCD4 71
5.2.7. Citoquinas producidasporloslinfocitosCD4~ 71
5.2.8. ActividadcitolíticadelascélulasCD4~ 73
5.2.9. Los linfocitos CD8~ 74
5.2.l0.LoslinfocitosTy5 74
5.2.11. Citoquinas: protección einmunopatología 75
5.2.12. El espectrodelarespuesta inmune 76
5.2.13. Lahipersensibilidadde tiporetardado 77
5.3. Factores de virulencia: efectos de los constituyentes de las micobacterias
en lafuncióndelosmacrófagos 78
5.3.1. Lossulfátidos 79
5.3.2. El cord factor 79
5.3.3.Ellipoarabinomanano 80
5.3.4. Las ceras 82
5.4. Laformación delaslesiones 82
6.TUBERCULOSIS, UNAENFERMEDADEMERGENTE 85
6.1. Epidemiología 87
6.2. AsociaciónentreVIHy tuberculosis 89
6.3. Cepas multirresistentes 89
6.4. Epidemiologíadela infecciónporAl. bovis en lossereshumanos 90
7. TUBERCULOSIS EN ANIMALES 98
7.1. Tuberculosisenelganadovacuno 98
7.1.1. Prevalenciamundialde latuberculosisene¡ganado vacuno 98
7.1.2. Patogénesis delas lesiones en el ganado vacuno 105
7.1.3. Localización de laslesiones 108
7.1.4.Sintomatología l(8
7.1.5. Infección por otras micobactenas ¡(9
7.1.6. Diagnósticoin vivode latuberculosis IIO
7.1.7. Control de la infección 122
7.2. Tuberculosisen la cabray en la oveja 125
7.3.Tuberculosisenel cerdo 126
7.3.1. InfecciónporAl. tuberculosisyelcomplejo Al. avium-intracellulare...127
7.4.Tuberculosis encaballos,asnosy mulas 128
7.5. Tuberculosis enperrosy gatos 128
7.5.1.Epizooúología 129
7.5.2.Patogénesis 131
7.5.3.Sintomatología 132
7.5.4.Hallazgosanatomopatológicos 134
7.5.5. Diagnóstico 135
7.5.6. Terapia 137
7.5.7. InfecciónporM aviwnen perrosy gatos 137
7.5.8. Infeccionesporotrasmicobacterias 139
7.6. Tuberculosisen camélidos 140
7.7. Tuberculosis en ciervos 141
7.7.1. Sintomatología y lesiones 143
7.7.2. Diagnóstico 144
7.7.3. Otras micobacterias 146
7.8.Tuberculosiseneljabalí 147
7.9. Tuberculosis en tejones 148
7.9.1.Diagnóstico 149
7.10.Tuberculosisenel conejo y laliebre 150
7.11. Tuberculosis en elpossum 15)
7.12. Tuberculosis en mustélidos 151
7.13.Tuberculosis en animañesexóticosy de roo 152
7.14. Tuberculosis en pinnípedos 153
7.15.Tuberculosisaviar 154
II. DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE TUBERCULOSIS A PARTIR DE MUESTRAS
CLÍNICASMEDIANTE AMPLIFICACIÓNDELADN DE LAS MICOBACTERL4S POR
PCR 159
Resumen 160
1. INTRODUCCION Jó
2. MATERIAL Y MÉTODOS 165
2.1. Informe de los animales y recogidade muestras 165
2.1.1. Ganadovacunoy caprino 165
2.1.2. Perros y gatos 165
2.1.3. Animalessalvajes 166
2.1.4. Aves 166
2.2. Bacteriología 171
2.2.1. Observación microscópica directa: tinciónde fluorescencia 171
2.2.2. Cultivo 172
2.2.3. Identificación 174
2.3. Identificación en muestras clínicas de organismos del complejo M.
tuberculosisyAl. avium-intracellulare porPCR 177
2.3.1. Desarrollo de una técnica de extracción del ADN a partir
de muestras tisulares 177
2.3.2. Evaluacióndel protocolo inicial de extracción del ADN a
partirdelas muestras 179
2.3.3. Amplificación del ADN 18)
2.3.4. Deteccióndelosproductosamplificadosen gel deagarosa 186
2.3.5. Southernblottingehibridación 186
2.3.6. Incremento de lasensibilidadconel desarrollode unPCR nested 189
2.3.7. Incremento de la sensibilidad modificando la técnica de extraccion
delADNde lasmicobacteriasapartirdemuestrastisulares 191
2.3.8. Evaluacióndelprotocolomodificadode extraccióndel ADN 195
3. RESULTADOS 203
3.1. Método elegido para la detección e identificación de tuberculosis en
muestras clínicas mediante PCR 203
3.2. DiagnósticoporPCRdelas muestrasdeganadovacuno 203
3.3. DiagnósticoporPCR delasmuestrasde perros y gatos 204
3.4. DiagnósticoporPCR delas muestras deaves 209
3.5. PCR nested 211
3.6. Modificacióndel protocolode extracción 212
3.7. Evaluación delnuevométodo de extracción 213
4. DISCUSION 231
III. TIPIFICACIÓN DE CEPAS DEL COMPLEJO M. tuberculosis MEDIANTE PCR
CONINICIADORESDE SECUENCIA ARBITRARIA 243
Resumen 244
1.INTRODUCCION 245
2. MATERIAL YMÉTODOS 247
2.1. Cepasutilizadasenesteestudio 247
2.2. Preparación del ADN 247
2.3. Elecciónde iniciadoresqueproduzcanunperfilde bandas 248
2.3.1. Iniciadoresutilizados 248
2.3.2. Lareacción dePCR 249
2.4. Optimizaciónde lascondicionesdela reacción 250
2.4.1. Optimización dela concentraciónde ADNdiana. 250
2.4.2. Optimizacióndelaconcentraciónde polimerasa 251
2.4.3. Optimizaciónde laconcentraciónde clorurode magnesio 251
2.4.4. Optimizaciónde latemperaturadehibridación 251
2.5. Evaluación delos iniciadoresy condiciones seleccionadas 252
2.6. Reproducibilidad de los resultados 252
2.7. Análisis RALPD con los iniciadores OPB-lO, OPC-20 e IS-l en la
tipificacióndecepasdelcomplejoAl. tuberculosis 253
3. RESULTADOS 255
3.1. Eleccióndelosiniciadores yreaccióndePCR 255
3.2. Optimizacióndelareacción 256
3.3. Evaluacióndelosiniciadoresseleccionados 257
3.4. Reproducibilidad de los resultados 257
3.5. AnálisisRAPD decepas delcomplejoM. tuberculosis 258
4. DISCUSIÓN 281