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Analytische Untersuchungen und chemometrische Modellierungen hinsichtlich des Transportverhaltens von Selenspezies in vitro mittels Ussing-Kammer-Technik Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt dem Rat der Chemisch-Geowissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität Jena von Diplomchemiker (Umweltchemie) Denis Pick geboren am 27.08.1983 in Pößneck Gutachter: 1. Prof. Dr. Jürgen W. Einax, Jena 2. Prof. Dr. Gerhard Jahreis, Jena Tag der öffentlichen Verteidigung: 17.04.2013 Abkürzungen AAS Atomabsorptionsspektrometrie AFS Atomfluoreszenzspektrometrie ANN Artificial neural network BG Bestimmungsgrenze CCT Collision cell technology CE Kapillarelektrophorese CNRC National Research Council Canada CRI Collision reaction interface DBT Dynamic bandpass tuning DMDSe Dimethyldiselenid DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung DMSe Dimethylselenid DRC Dynamic reaction cell DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EDTA Ethylendiamintetraacetat EG Erfassungsgrenze FNB Food and Nutrition Board GC Gaschromatografie GE Gelelektrophorese γ-Glu-MeSEC γ-Glutamyl-Se-Methylselenocystein GPx Glutathionperoxidase GRNN Generalized regression neural network GSH Glutathion GSSG Glutathiondisulfid HBSS Hank’s balanced salt solution HE Haupteffekte HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatografie ICP-MS Inductively coupled plasma mass spectrometry ICP-OES Inductively coupled plasma optical emission spectrometry IDIO Iodthyronin-Deiodinase IEC Ion exchange chromatography INMS Institute for National Measurement Standards KG Körpergewicht LA-ICP-MS Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry LD Letale Dosis LOH Fettsäurealkohol LOOH Lipidhydroperoxid MeOH Methanol MeSEC Selen-Methylselenocystein MeWe Mediumwechsel MIP-OES Mikrowellen-induzierte Plasmaemissionsspektrometrie MLP Multilayer perceptron MLR Multiple lineare Regression MW Mittelwert NG Nachweisgrenze NOAEL No observed adverse effect level OK Opossum kidney (Opossum Nierenepithelzellen) PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PC Polycarbonat PEEK Polyetheretherketon PET Polyethylenterephthalat PLS Partial-Least-Squares-Regression PN Probennahmezeitpunkt PP Polypropylen PRESS Predicted residual sum of squares PTFE Polytetrafluorethylen PW Prüfwert RBF Radiale Basisfunktion RDA Recommended dietary allowance RMSEP Root mean square error of prediction RPC Reversed-phase chromatography RPIPC Reversed-phase ion-pair chromatography SCF Scientific Committee on Food SDS-PAGE Natrium-dodecyl-sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SEC Size exclusion chromatography SeCys Selenocystein SeCys Selenocystin 2 SeMet Selenomethionin SePP Selenoprotein P SPME Solid phase microextraction SPS2 Selenophosphat-Synthetase 2 SVP Statistische Versuchsplanung TEAH Tetraethylammoniumhydroxid TEER Transepithelialer elektrischer Widerstand TFA Trifluoressigsäure TMAH Tetramethylammoniumhydroxid TMSe+ Trimethylselenium-Ion TRIS Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan TRxR Thioredoxin-Reduktase TW Tabellenwert VB Vertrauensbereich WE Wechselwirkungseffekte WFR Wiederfindungsrate WHO World Health Organization Formelverzeichnis a Achsenabschnitt der Kalibriergeraden α Signifikanzniveau (Wahrscheinlichkeit für Fehler 1. Art) A Fläche b Steigung der Kalibriergeraden β Signifikanzniveau (Wahrscheinlichkeit für Fehler 2. Art) B Regressionskoeffizient i B Absolutglied 0 B* Signifikanzschranke c Konzentration DS2 Differenz der Abweichungsquadrate f Zahl der Freiheitsgrade G Gewebeleitfähigkeit t I Stromstärke k Faktor der vorgegebenen Messunsicherheit oder Zahl der Variablen m Zahl der Messungen oder Zahl der Faktorstufen n Zahl der Kalibrierstandards oder Zahl der Wiederholbestimmungen N Zahl der Versuche P Statistische Sicherheit P Apparent permeability coefficient app PD Transepitheliale Potenzialdifferenz t P Durchlässigkeit in Richtung serosaler Seite serosal Φ Faktor zur Schnellschätzung bei der Kalibriergeradenmethode α n, 2 Q Summe der Abweichungsquadrate x r Korrelationskoeffizient r2 Bestimmtheitsmaß R Widerstand RSD Relative Standardabweichung R Gewebewiderstand t s Standardabweichung s2 Varianz s Fehler des Regressionskoeffizienten B s 2 Einzelvarianz k s 2 Restvarianz R s Verfahrensstandardabweichung x0 s Mittlerer Messfehler y s Reststandardabweichung yx s Reststandardabweichung der linearen Kalibration y1 s Reststandardabweichung der quadratischen Kalibration y2 t Zeit t Quantil der t-Verteilung f,α T Transportrate in Richtung serosaler Seite serosal U Spannung V Volumen V Verfahrensvariationskoeffizient x0 y Referenzwert i yˆ Vorhergesagter Wert i Inhaltsverzeichnis Seitenzahl Abkürzungen Formelverzeichnis 1 Einleitung und Problemstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Selen und Selenspezies 3 2.1.1 Vorkommen und Anwendung 3 2.1.2 Toxizität und Essenzialität 6 2.1.3 Physiologische Bedeutung und Selenstatus 8 2.1.4 Bioverfügbarkeit und Resorption im Menschen 12 2.1.5 Selenmetabolismus 13 2.2 Humane Adenokarzinomzelllinie Caco-2 15 2.3 Ussing-Kammer-Technik 16 2.4 Kopplung der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie mit induktiv- gekoppelter Plasmamassenspektrometrie 18 2.4.1 Chromatografische Trennung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie 18 2.4.1.1 Umkehrphasen-Chromatografie (RPC) 19 2.4.1.2 Umkehrphasen-Ionenpaar-Chromatografie (RPIPC) 19 2.4.1.3 Größenausschluss-Chromatografie (SEC) 20 2.4.1.4 Ionenaustausch-Chromatografie (IEC) 21 2.4.2 Detektion mittels induktiv-gekoppelter Plasmamassenspektrometrie mit dynamischer Reaktionszelle (ICP-DRC-MS) 22 2.4.3 Selenspeziesanalytik mit HPLC-ICP–MS 24 2.4.4 Andere Methoden der Selenspeziesanalytik 26 2.5 Chemometrische Methoden 27 2.5.1 Statistische Versuchsplanung (SVP) 28 2.5.2 Multiple lineare Regression (MLR) 31 2.5.3 Partial-Least-Squares-Regression (PLS) 33 2.5.4 Künstliche neuronale Netzwerke (ANN) 34 3 Experimenteller Teil 36 3.1 Standardzellkultivierung 36 3.2 Ussing-Kammer-Experimente 37 3.2.1 Kultivierung der Caco-2-Zellen auf Snapwell®-Einsätzen 37 3.2.2 Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) 38 3.2.3 Experimentelle Bedingungen 39 3.2.3.1 Ussing-Kammer 39 3.2.3.2 Elektrophysiologische Parameter 40 3.2.3.3 Transportexperimente mittels statistischer Versuchsplanung 41 3.2.3.4 Akkumulationsexperimente 43 3.3 Enzymatische Hydrolyse des zertifizierten Referenzmaterials 43 3.4 Apparative Messbedingungen und Kalibration 44 3.4.1 Bestimmung des Selengesamtgehaltes mittels ICP-DRC-MS 44 3.4.2 Selenspeziesanalytik mittels HPLC-ICP-DRC-MS 45 3.5 Statistische Auswertung 47 4 Methodenentwicklung und Validierung der Selenspeziesanalytik 48 4.1 Kopplung von Umkehrphasen-Chromatografie mit ICP-DRC-MS 48 4.2 Kopplung von Anionenaustausch-Chromatografie mit ICP-DRC-MS 49 4.2.1 Untersuchungen zur Zusammensetzung der mobilen Phase 50 4.2.2 Wahl eines geeigneten Messisotops 51 4.2.3 Optimierung der Messbedingungen 53 4.3 Validierung 54 4.3.1 Linearität 55 4.3.2 Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze 58 4.3.3 Präzision 60 4.3.4 Richtigkeit 62 4.3.4.1 Analyse des zertifizierten Referenzmaterials 62 4.3.4.2 Wiederfindungsexperimente 63 4.3.5 Selektivität und Robustheit 66 5 Transportverhalten der Selenspezies in vitro 68 5.1 Voruntersuchungen zu den Ussing-Kammer-Experimenten 68 5.1.1 Einfluss des Membranmaterials der Snapwell®-Einsätze 68 5.1.2 Überprüfung der Monolayerintegrität 69 5.2 Transportexperimente 71 5.2.1 Einzelapplikation der Selenspezies 71 5.2.2 Applikation von zwei konzentrationsabhängigen Selenspeziesmischungen 76 5.2.3 Vergleich beider Applikationsformen 78 5.3 Akkumulation der Selenspezies durch Caco-2-Zellen 81 6 Bewertung und Interpretation der Zellexperimente mittels chemometrischer Methoden 83 6.1 Regressionsanalyse mit Wechselwirkungseffekten des 24-Faktorenplans 83 6.2 Regressionsanalyse ohne Wechselwirkungseffekte 87 6.3 Modellierung mit PLS 89 6.4 Modellierung mit ANN 91 6.5 Vergleich der verwendeten chemometrischen Methoden 94 7 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen 96 Literaturverzeichnis Anhang Danksagung Selbständigkeitserklärung Lebenslauf
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