Analytische Chemie LC / HPLC

24 Pages·2008·3.07 MB·German

by  Xiangyang Zhang

Analytische Chemie
für Biologie Pharmazie Bewegungs-

wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und
Elektrophoretische Trennverfahren
LC / HPLC
12.11.2008 AC – BPBS HS08 1

LC / HPLC
High-Pressure-Liquid-Chromatography
Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
High-Performance-Liquid-Chromatography !
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
High-Price-Liquid-Chromatography
HPLC vs GC Unterarten HPLC
Apparatur Detektoren
Trennprinzip Dünnschichtchromatographie
Mobile Phase
Säule und Stationäre Phase Wahl einer Methode
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Warum HPLC ?
•! GC: nur Trennung von Substanzen, die sich bis ca. 300°C
unzersetzt verdampfen lassen
•! Sehr polare und thermisch labile Substanzen
•! Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere
•! Selektivität hängt ...... ab
von der stationären Phase
!!
von der mobilen Phase (Polarität, Gradientselution)
!!
•! Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer
(kleinere Diffusionskoeffizienten), Hochdruck ist nötig
•! Analytische, Präparative und Produktive
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Apparatur
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Schematisch HPLC
Eluentvorrat (Entgaser, Aufteilungsvalve)!
He/Ar
Pumpe (reproduzierbar und konstant Druck)!
Injektor (bestimmte Menge zur Säule)!
300 – 400 bar!
(2) Pumpe!
LM 10 ml/min!
Filter/Vorsäule (fein Partikel)!
(1a) LM Behälter!
Säule !
Detektor!
Vor- und Nach-
(1b) LM Aufteilungsventil! Derivatisierungsteile!
(6) Detektor!
(5) Vorsäule/Trennsäule! (3) Filter!
(4) Injektorventil!
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6-Wege-Ventile
Probe ein! Probe ein!
Probe aus! Probe aus!
zur Säule! zur Säule!
Probenschleife!
Eluens! Eluens!
Laden ! Injizieren!
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HPLC Säule
Physikalische Eigenschaften:!
SiO : ideale SP (NP)
2
•! Partikelgrösse, Form und
Al O , ZrO
Grössenverteilung 2 3 2
•! Porosität, Porengrösse, Oberfläche
Polymere: Copolymere von
und Volumen
Styrol und Divinylbenzol
•! Stärke (mechanisch) gegen Druck und
Lösungsmettel (Bruch und Deformation)
L: 10-50 cm
ID: 1-10 mm
HPLC Säule Stahlrohre porösen Partikeln (3-10 !m)
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Trennprinzip
Normalphasenchromatographie – Adsorption/Verteilung
Umkehrphasenchromatographie – Verteilung/Adsorption
Stationäre Phase Mobile Phase Elutionsreihenfolge Bezeichnung
der Analyten
polar apolar (z.B. Hexan) apolar vor polar Normalphasen (NP)
apolar Polar (z.B. Wasser) polar vor apolar Umkehrphasen
(RP: reversed-phase)
!
Grössenausschlusschromatographie – Molekülgrösse
Ionenaustauschenchromatographie – Ionische Wechselwirkung
Affinitätschromatographie – Ligand-Bindungsaffinität
Komplexierungschromatographie – Metal-Ligand-Komplexierung
Chiralchromatographie – Diastereomere-Bildung
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Klassische Theorie
Verteilungskoeffizient Bodenzahl und Bodenhöhe
[A] L t2 # t & 2
K = S N = = R =16% R(
[A] tB H "2 $ w’
M
L " w% 2B
Retentionszeit / Geschwindigkeit tA H = $ ’
! tR' = tR " tM e Signalhöhe hu= tLMtM v = !tLR N =1N6Ae#ff t"R#$%& k k+1&’( 2 =#$% )tR' &’( 2"#$% kk+1&’( 2
ert
Retentionsfaktor mi/ Kapazitätsfaktor!
t " t nort' V Auflösung
! k = R M = R k =K s t "t 2(t "t )
!t t! V R = B A = B A
M M M! w + w w + w
wAB wBA Zeit B A
Trennfaktor / Selektivätsfaktor 2
K k (t' ) $ "#1’ k N
"= B "= B "= R B R =& ) * B *
! K ! k (t' ) % " ( 1+ k 4
A A R A B
!
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! ! ! !
Van Deemter Gleichung
2k #D $ f(d2,d2) q#k#d2 ’
H =2"#d + D M + u#& p c + f )
p u D (1+ k)2D
% (
M S
A! B! C!
H!

e
h
ö
h
! n
e
d
o
B

e
h
Minimum H!
c
s
ti
e
r
o
e
h
T
Minimaler H-Wert!
optimale u!
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Eddy Diffusion

B
! H = A+ +C"u "
u
d Teilchendurchmesser
A Term: die eddy Diffusion A =2"#"d p
p ! Packungsfaktor
(diese tritt nur bei gepackten Säulen auf)
!
!
Ausmass
2
Homogenität
1
Dichte 1 2
Wegen Umwanderung der Molekül durch die Partikel des
Packungs-materials legen die Analyten unterschiedliche
Weglängen zurück.
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Longitudinale Diffusion

B
H = A+ +C"u
u
B 2k D
B Term: die longitudinale Diffusion = D M
u u
In GC: B Term => einen D : Diffusionskoeffizienten
! M
entscheidenden Beitrag zu in der mobilen Phase,
Peakverbreiterung leistet, k : Labyrinthfaktor,
D
insbesondere bei niedrigen u. !c onstant
In der LC kann der B-Term wegen der sehr kleinen D -Werte ignoriert werden.
M
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Massentransport-Effekte

B
H = A+ +C"u
u
C Term: die Masstransfer zwischen den zwei Phasen
C"u=C "u+C "u
S M
!
u
qk"d2 "u In flüssigstationären Phase
C "u= f
S (1+ k)2"D Filmdicke df und DS
! S
2t "k"u In feststationären
C "u= d
HETP S (1+ k)2 Phase
sehr klein
Gleichgewichts
! Desorptions-
einstellung f(d2,d2)u In der mobilen Phase
C "u= p c geschwindigkeit t "0
In HPLC, klein Dd =>
M D M
M grosse C
! M
Gleichgewichtseinstellung zwischen S/M Phasen benötigt Zeit => da die
mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand
nicht vollständig einstellen => Zunahme der Höhe eines theoretischen Boden
(HETP) !
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Mobile Phase
Reinheit, Inert, Preis
Korrosionsbeständigkeit, Toxizität
UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex
Mischbarkeit
Haltbarkeit
!! Elutionsstärke
Polarität, Viskosität!
!! Selektivität
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Reihenfolge der Lösungsmittel nach
zunehmender Polarität
n-Heptan, n-Hexan, Cyclohexan, Isooctan
Tetrachlorkohlenstoff
Toluen, Chlorbenzen, Benzen
Diethylether, Chloroform, Dichlormethan
1-Butanol, Pyridin, Acetonitril, 2-Propanol
Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Aceton
Ethanol, Methanol, Dimethylformamid
Wasser, wässrige Pufferlösungen
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Polarität von Molekülen
12.11.2008 AC – BPBS HS08 16
Eluent–Gradient
Isokratische Trennung: Eluent bleibt
während des Laufs unverändert.
Gradiententrennung: Eluent wird
während des Laufs verändert.
12.11.2008 AC – BPBS HS08 17
Stationäre Phase
Original SiO , Al O : Polare OH-Gruppe
2 2 3
Modifikation: R1
R
Cl Si
R
1
OH R2 O R
Si Si Si
R
2
Entcapping:
OH HN[Si(CH3)3]2 O
Si Si Si(CH )
3 3
12.11.2008 AC – BPBS HS08 18
Normalphase (NP)
Modifizierte polare NP:
R
1
Cyano (C –CN)
3 O Si CN
R
2
R
Amino (C –NH ) 1
3 2
O Si
NH
2
R
2
Diol (C –OCH CH(OH)CH (OH)
3 2 2 R1
O Si O OH
R
2 OH
19.11.2008 AC – BPBS HS08 19
Modifizierte NP-Säule
Hydrophile Eigenschaft
Nonpolare Mobile Phase
z.B., Kohlenwasserstoff
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