Analyse par spectrométrie de masse de l'oxygène moléculaire singulet et de protéines ...

346 Pages·2011·19.85 MB·French

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A L'UNIVERSITE DE I4ETZ L-::t i{l
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DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PAUL VERLAINE DE '|fiETZ
Par
Marc DODELLER
Analysep ar Spectrométried e Massed e I'oxygène
moléculaires ingulete t de protéinesp otentiellement
cibléesa u seind e cellulest umoralesl ors de ra
ThérapieP hotodynamique
Le 29 Juin 2007
Rapporteurs:
Jacques Einhorn, Directeur de Recherchea u Département Santé tles Plantes et Environnement,
INRA section protéomique, Plateforme de Spectrométrie de Masse et Chimie Analytique,
Versailles.
Patricia Vicendo, Chargée de Recherche au Laboratoires des Interactions Moléculaires et
RéactivitéC himiquese t Photochir.niqu(eIM RCP), universitéP aul Sabatier,T oulouse.
Examinateurs:
Alain Van Dorsselaer, Professeur et directeur du Laboratoire de Spectroméfried e Masse
Bio-Organique,D épartementd es Sciencesa nalytiques,I nstitut pluridisciplinaireH ubert Curien,
Universitéd e Sfasbourg.
Lina Bezdetnaya-Bolotine,P rofesseurA ssocié,a u CentreA lexis Vautrin, UniversitéN ancy I.
Benoît Maunit, Maître de Conférencesa u Laboratoired e Spectrométried e Masse et de Chimie
Laser,U niversitéP aul Verlaine , Metz.
Directeur de thèse:
Jean-François Muller, ProfesseurE mérite du Laboratoire de Spechométried e Masse et de
ChirnieL aser,U niversitéP aulV erlaine,M etz.
BU METZ : Saulcy
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0400093446
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RnunncrEMENTS
Cetteé tudea été réaIisées ousl a directiond e ProfesseuJr ean-FrançoiMs uller au
Laboratoire de Spectrométried e Masse et Chimie Laser de I'Université Paul
Verlaine-Metz.
Monsieur le ProfesseurE mérite Jean-FrançoisM uller
Je vous exprime ici ma profonde et sincère gratitude pour m'avoir accueilli
chaleureusemenatu seind e votre laboratoirep, our la confianceq ue vous m'avez
accordé.D e plus, Je vous suis profondémentr econnaissandt e m'avoir offert
l'opportunité de présenter mes résultats au cours de congrès nationaux et
intemationaux,d 'effectuer des formations, d'avoir mis à ma disposition les
moyensm atériels,f inanciersa insi que vos relationsp our réaliserc e travail.
Merci encorep our les encouragementes t les échangess cientifiquesq ue vous
m'avez apporté.
J'adressem on profond respect à Monsieur le ProfesseurJ acquesE inhorn
(INRA section protéomique, Versailles) et Madame le Docteur Patricia
Vicendo (IMRCP-LMR 5623, UniversitéP aul Sabatier,T oulouse)q ui me font
I'honneur d'être membre de jury de cette Thèse et d'accepterd 'en être les
rapporteurs.
Mes remerciementsl es plus sincèress 'adrassenté galementà Monsieur le
Professeur Alain Van Dorsselaer (LSMBO - UMR 7178, Strasbourg)e t à
Madame Lina Bezdetnaya-Bototine (Professeura ssociéea u CRAN-CAV-
UMR 7039, Vandoeuwe les Nancy) pour I'honneur qu'ils me témoignente n
acceptantd e juger ce travai.l,J e tiens tout particulièrementà te remercierL ina
pour I'attentiont oute particulièreq ue fu as porté à ce fravail. Tes remarqueso nt
toujoursé tép ositivese t constructives.
Monsieur Benoît Maunit (Maître de Conferenceà l'Université Paul Verlaine-
Metz)
Je souhaitet e remerciert out particulièremenct ar tu as fait preuvet out au long
de ma thèsed 'enthousiasmed, e disponibilitée t de courage.T u as su trouver les
mots justes pour me motiver et me pousser vers I'avant lorsque c'était
nécessaireA. ton contact,i l m'a étép ossibled 'apprendreé normémentta nt d'un
point de r,ue scientifique,q ue sur le plan pédagogiqueJ. e te remercied onc
sincèremendt 'avoir contribuét rèsa ctivementà mon encadrement.
Monsieur Ie Professeur François Guillemin, responsabled e I'unité de
recherchee n thérapiep hotodynamiqued u CentreA lexis Vautrin (CRAN-CAV,
Vandoeuwel es Nancy)
Je tiens à vous adresserm a reconnaissancpeo ur l'intérêt et I'appui que vous
avez apportésà la réalisationd e cest ravaux.
La Ligue Contre le Cancer,R égionL orraine
Je vous suis profondémentr econnaissanpt our le précieuxs outienf inancierq ue
vous m'avez accordéd urantc est rois ans.
Les membresd e I'équipe du Laboratoire de Spectrométried e Massee t de
Chimie Laser (LSMCL)
Je remerciec haleureusemenMt essieursG abriel Krier (Ingénieurd e Recherches)
et Lionel Vernex-Loset( Ingénieurd 'étude)p our leur assistance(l esj ours feriés)
et leurs compétencetse chniques.
Je tiens égalementà exprimer ma gratitude à Monsieur le Directeur Jean-
Jacques Gaumet (Maître de Conférences - HDR) [nihon no restoranto de
tabemono wo takenai], à Messieurs Eric Millon (professeur< expatrié> à
Orléans)e t Frédéric Aubriet (chasseura yant domptél a bête FT) et à madame
RachelleC hety (bientôtt u nousp résenterale petit).
J'exprime toute ma reconnaissanceà mes collèguese t amis du LSMCL pour
tous les bons moments passése nsemble; les anciens doctorants qui m'ont
accueilliea u sein de la grandef amille du LSMCL : Natacha" la louve" Lourette
(mon mentor, elle qui m'a tout appris et qui a présent roule en gros 4x4 au
States)M arc Angotti (SponsorB ruker),E ric Erel (nihonjin iie desu,s o desun e),
Jérôme Bour (le P'tit Djé) et David Ruch (l'homme du Luxembourg);n otre
secrétaired e choc et de chagmeF idélia Boninségnia( fournisseuseo fficielle de
café et de thé) ; les actuels qui ont partagém on mes heuresd e travail et de
counter-striken otamment: JérémieC astellod it T-man (u j'ai téléchargéb leach
en I minute 5 secondes> ) que j'ai croisé très souventl es dimanchesa u labo,
Audrey Hecka (< Alors vieux Marc tu te promènesa vect a tasse? >) dont les
"tisanes" conduiront à des grands travaux , SébastienK illburger (notre kiki
préféré),G regory Ham dit Greg la bossem embre de I'Olympique Moléculaire,
Nicolas "Exposito" dit Nico le Bo membre actif des Ennemy down, Junien
"Barthen"d it Mc Adam dont les correctionsin terminableslu i ont coûtéq uelques
heures de sommeil, David Da Silva dit Mikeu Fickeu (mon poulain), Cyrill
Guérande(l l'homme du (de) béton),P aul Hannewald( c'est pas sérieux,a rrête
de jouer à CS), Gilles Fraches( e prends 3 journéess ur le MALDI) et les
futurs...(Cyriell?e)
Les membres de l'équipe du Laboratoire de Recherched u Centre Alexis
Vautrin (CRAN-CAV, Vandoeuvrel es Nancy) et du Département de Chimie
Physique des Réactions,E NSIC-INPL (Nancy), au Pr. Jean-LouisM erlin qui
m'a chaleureusemenotu vert les portesd e son laboratoire.L es "filles" qui m'ont
toujours accueillis avec sympathie et bienveillance; tout particulièrement
Muriel Barberi-Heyob,L oraine Tirand, Noémie Thomase t Céline Frochotd ont
les premiers échantillonsé taient parfois solubilisésd ans du DMSO mais qui
donnèrennt éanmoinsd 'excellentsr ésultats.
De moult remerciementvso nt égalemenàt I'encontred 'AurélieF rançoisq ui m'a
maintes fois fourni en cellules afin que je puisse remplir mon devoir de
doctorant.
Le Laboratoire IMAC "Mesures photophysiquese t instrumentation" du
Centre Alexis Vautrin (CRAN-CAV, Vandoeuvrele sN ancy)
Je suis profondémentr econnaissanat u Dr. JacquesD IDELON qui m'a autorisé
de me servir de sa plateformed 'illumination, sansl aquellej e n'auraisp u mener
à bienm esi rradiations.
Le Laboratoire de Spectrométrie de Masse et Bio-Organique (LSMBO,
Strasbourg)
Je remerciel 'équipe du LSMBO qui m'a permis d'entre apercevoirl e monded e
la protéomique,D r Jean-MarcS trub et plus particulièrementM adame Danièle
Thiersep our m'avoir "initié" à la réalisationd 'électrophorèseb idimensionnelle
SDS-PAGE.
L'Ecole DoctoraleS ESAMES
L'aide financièreq ue l'écoie doctoraleS ESAMES,d irigée par le Professeur
Daniel Canet (MéthodologieR MN (UMR 7s65 CNRS-UHp), Vandoeuwel es
Nancy) m'a accordée,m 'ayant permis de participer à mon premier congrès
international( PDT & PDD 2006,B rixen, Italie). Je vous en suis profondément
recoruraissanct ar j'ai pu pour la première fois présenterm es travaux à une
coflrmunautés cientfi ique internationale.
Le GraduiertenKolleg (GRI( 532)
Commentn e pas évoquerl e Graduiertenkolleg(,G RK) réseauf ranco-allemand
permettantd e nombreux échangesa ussib ien sur le plan scientifiqueq ue sur le
planh umain.
Enfin, merci à mes arnis et ma farnitte fe m'ayoir souterut
yen{artt ces trois 6LTLySa,r ticufrèrement ma" mère you:r son
affection et ses nornbreLLseysr ovisiorLs, morL yère [ont te
ffivouement scnns ftmites m'a yermis fe yoursuiyre mes
étufes, ma. soeur qui me so'tltenait mafgré fa û.startce et ma
Soyhie qui teiftait sLarm oi tout en suyJlortant rnes a1sences
rtotarrwnent fe soir, fe weeÊ.-enfe t fesjo urs
fériés.
Merci à Hewlett Packard et à Canon pour avoir construis des imprimantes et des photocopieurs de qualité.
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# TABLE DESM ATIERES
1:
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TABLE DES MATIERES
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$ INTRODUCTIONG ENERALE
tr
-
Chapitre f La Thérapie Photodynamique
1. Origine et applicationsd u traitement PDT 8
1.1. Historique 8
1.2. Lathérapiep hotodynamique- son intérêt 1l
2. Les mécanismesd e la PDT t2
2.I. Les mécanismesp hotochimiquesd e la PDT t2
2.2. Le rôle de I'oxygènem oléculaire t4
2.2.1. Générationd 'espèceso xygénéesré actives( ROS) t4
:x
2.2.2. Action de l'oxygène singuleta u niveauc ellulaire r6
I
2.2.2.1. Dommagesc ellulairesd irects 18
2.2.2.2. Dommagesc ellulairesi ndirects 20
I'
2.3. Les sourceslu mineusesà estinéesà la PDT 22
2.3.I. Les differentess ourceslu mineuses 22
2.3.2. Dosimétrielumineuse 28
2.4. Sourceslu mineusesu tiliséeslo rs de nosé tudese n PDT 30
B
T
t
3. La nature desa gentst hérapeutiquesu tilisése n PDT 36
G
3.1. Critèresd u photosensibilisateiudré al 36
$
3.2. Nomenclatured e porphyrines a1
JI
# 3.3. Photosensibilisateurnsa turelso u partiellements lmthétiques. 39
3.4. Photosensibilisateurssy nthétiques. 44
#
3.5. Agentst hérapeutiquecso mmercialisés. 45
3.5.i. Photofrin@ 45
3.5.2. L'acide 5-aminolévuliniqu(e5 -ALA) 46
3.5.3. La Visudvne@ 47
3.5.4. Laméso-tétrahydroxyphénylchlorin(em -THPC,F oscan@) 48
3.6. Les photosensibilisateurdse 3èmeg énération. 52
4. De la PDT vers la spectrométried e masse 58
Chapitre II - Spectrométried e massee t spectroscopie- Partie
instrumentale
1. Les différentess ourcesd 'ionisation 64
1.1. L'ionisation par désorptionl asera ssistéep ar matrice( matrix assistedla ser
desorption/ionization: MALDI) 65
1.1. 1 . Historique 6s
8t
1.1.2. Principed e la techniqueM ALDI 66
F
1.1.3. La formationd esi ons 67
1.1.3.1. Désorptioent formationd esi ons 67
#,
*r
1.1.4. Réactionss econdairedsa nsl e nuageg azeLrx 69
ë 1.1.5. Conditionnemendtu supportd 'analyse- échantillonnagMe ALDI 72
r
1.1.5.1. Le conditionnemednet l'échantillon 72
s
I.1.5.2. Les differentst ypesd e dépôtsu suels 73
1.1.5.3. La matrice 74
T
1.1.5.4. Sélectiond e la matriced ansl e cadred e notreé tude 75
1. 1.5.5. Etalonnaged ess pectresd e masse 78
T
I
1.1.5.6. Conclusion 81
'l
1.2. La sourced 'ionisationp ar électronébulisatio(né lectrosprayE, SI) 81
'Ê 1.2.1. Le principe 81
1.2.2. La formationd esi ons dansl e nuageg azenx 83
I.2.2.1. Formationd u Spray 83
L2.2.2. La fissiond ese outtelettes 83
1.2.2.3. La formationO l",, on, en phaseg azeuse 83
I.2.2.4. Le calculd e la masse 86
1.2.3. Spécificitéd e notre sourceé lectrospray 89
,5
2. Les spectromètresd e masseu tilisésl ors de nosé tudes. 9l
i
2.1. Lespectromètred e masseU 'r"rnp.d e vol (Time of Flight : TOF) 9l
2.I.I. Principed e I'analyseuàr tempsd e vol (TOF) 92
2.1.2. Evolution de la techniQueT OF/MS 95
c 2.1.2.1. Le retardà I'extraction" Delaye xtraction" 96
2.1.2.2. Le miroir électrostatiqu(ele réflectron) 98
2.1.3. Techniqued 'analyseà partir d'un ion présélectionné 100