analisi proteomica in linee di frumento duro high-amylose transgeniche e corrispondenti wild-type

153 Pages·2012·5.43 MB·Italian

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELLA TUSCIA DI VITERBO

DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE PER L’AGRICOLTURA, LE
FORESTE, LA NATURA E L’ENERGIA
(DAFNE)

CORSO DI DOTTORATO DI RICERCA
BIOTECNOLOGIE VEGETALI XXIV CICLO.

ANALISI PROTEOMICA IN LINEE DI FRUMENTO DURO
HIGH-AMYLOSE TRANSGENICHE E CORRISPONDENTI
WILD-TYPE

AGR-07

Coordinatore: Prof.ssa Stefania Masci
Firma ……………………..
Tutor: Prof. Domenico Lafiandra;
Firma……………………
Dott. Francesco Sestili
Firma………………………

Dottoranda: Federica Paoletti
Firma ……………………
0
1
ABSTRACT ...................................................................................................................... 6
RIASSUNTO .................................................................................................................... 8
1. INTRODUZIONE ...................................................................................................... 12
1.1 Il frumento ............................................................................................................. 12
1.1.1 Origine dei frumenti ....................................................................................... 13
1.1.2 Struttura e composizione della cariosside di frumento ................................... 15
1.1.2.1 Tegumenti ................................................................................................ 15
1.1.2.2 L’endosperma e l’embrione ..................................................................... 16
1.1.2.3 Endosperma in via di sviluppo ................................................................. 17
1.2 Proteine della cariosside ........................................................................................ 18
1.2.1 Albumine e globuline ..................................................................................... 19
1.2.1.1 Le puroindoline ........................................................................................ 20
1.2.1.2 α-amilasi/ tripsina inibitori ...................................................................... 22
1.2.1.3 Le β-amilasi ............................................................................................. 22
1.2.1.4 Serpine ..................................................................................................... 23
1.2.1.5 Heat Shock Protein .................................................................................. 23
1.2.1.6 LTP .......................................................................................................... 24
1.2.2 Le prolammine ................................................................................................ 24
1.2.2.1 Gliadine .................................................................................................... 24
1.2.2.2 Glutenine .................................................................................................. 27
1.3 L’amido ................................................................................................................. 30
1.3.1 Struttura ed organizzazione dell’amido .......................................................... 31
1.3.2 Biosintesi dell’amido ...................................................................................... 34
1.3.3 ADPGlucosio pirofosforilasi .......................................................................... 35
1.3.4 Sintesi dell’amilosio ....................................................................................... 36
1.3.5 Sintesi dell’amilopectina ................................................................................ 38
1.3.5.1 Le amido sintasi di classe I (SSI) ............................................................. 38
1.3.5.2 Le amido sintasi di classe II (SSII) .......................................................... 39
1.3.5.3 Le amido sintasi di classe III (SSIII) ....................................................... 40
1.3.5.4 Le amido sintasi di classe IV ................................................................... 40
1.3.5.5 Gli enzimi di ramificazione di classe I (BEI) .......................................... 41
1.3.5.6 Gli enzimi di ramificazione di classe II (BEIIa e BEIIb) ........................ 42
1.3.5.7 Gli enzimi di deramificazione .................................................................. 43
2
1.3.6 Funzione di altri geni nella sintesi dell’amido ............................................... 44
1.3.8 Regolazione della biosintesi dell’amido ......................................................... 45
1.3.9 Proteine legate ai granuli di amido ................................................................. 46
1.3.10 Applicazioni e usi dell’amido nell’industria alimentare .............................. 47
1.3.11 Applicazioni ed usi dell’amido nell’industrie non alimentari ...................... 49
1.4 Proteomica ............................................................................................................. 50
1.4.1 Spettrometria di massa ................................................................................... 51
1.4.2 Proteomica comparativa ................................................................................. 54
1.5 Miglioramento genetico ........................................................................................ 55
1.6 Ingegneria genetica ............................................................................................... 56
1.6.1 Valutazione della sicurezza delle colture GM ................................................ 57
1.6.2 Metodo biolistico ............................................................................................ 60
1.6.3 Trasformazione con Agrobacterium tumefaciens ........................................... 61
1.6.4 Rna-interference ............................................................................................. 63
2. FINALITÀ .................................................................................................................. 68
3 MATERIALI E METODI ........................................................................................... 72
3.1 MATERIALI ......................................................................................................... 72
3.2 METODI ............................................................................................................... 72
3.2.1 Analisi delle proteine legate ai granuli d'amido ............................................. 72
3.2.1.1 Isolamento dei granuli d'amido ................................................................ 72
3.2.1.2 Estrazione delle proteine legate ai granuli d'amido ................................. 73
3.2.1.3 Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS .................... 73
3.2.1.4 Quantificazione delle proteine legate ai granuli: saggio Bradford .......... 74
3.2.1.5 Elettroforesi bidimensionale delle proteine legate ai granuli .................. 74
3.2.1.6 Colorazione delle proteine estratte dai granuli di amido e acquisizione
dei gel ....................................................................................................... 75
3.2.1.7 Analisi d’immagine .................................................................................. 75
3.2.2 Analisi delle proteine metaboliche ................................................................. 76
3.2.2.1 Estrazione delle proteine metaboliche ..................................................... 76
3.2.2.2 Quantificazione delle proteine metaboliche ............................................ 77
3.2.2.3 Elettroforesi bidimensionale delle proteine metaboliche ......................... 77
3.2.2.4 Colorazione dei gel e acquisizione .......................................................... 77
3.3.3 Identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa ..................... 78
3
4 RISULTATI E DISCUSSIONE .................................................................................. 82
4.1 Analisi delle proteine legate ai granuli di amido di Svevo e MJ16-112 ............... 83
4.1.1 Analisi SDS-PAGE (1D) delle proteine legate ai granuli di amido in Svevo e
MJ16-112 a 15 DPA e 36 DPA .................................................................... 83
4.1.2.1 Analisi bidimensionale (2D) delle proteine legate ai granuli di amido in
Svevo e MJ16-112 a 15 DPA .................................................................. 84
4.1.3 Analisi bidimensionale (2D) delle proteine legate ai granuli di amido in
Svevo e MJ16-112 a 36 DPA ......................................................................... 88
4.2 Analisi delle proteine solubili di Svevo eMJ16-112 ............................................. 91
4.2.1 Analisi bidimensionale delle proteine solubili in Svevo e MJ16-112 a
15 DPA ............................................................................................................ 91
4.2.2 Analisi bidimensionale delle proteine solubili in Svevo e MJ16-112 a
36 DPA ........................................................................................................... 93
4.3 Analisi delle proteine legate ai granuli di amido di Ofanto e A431_4p1a ............ 96
4.3.1 Analisi SDS-PAGE (1D) delle proteine legate ai granuli di amido in Ofanto e
A431_4p1a a 15 DPA e 36 DPA ................................................................... 96
4.3.2.1 Analisi bidimensionale (2D) delle proteine legate ai granuli di amido in
Ofanto e A431_4p1a a 15 DPA ............................................................... 97
4.1.3 Analisi bidimensionale (2D) delle proteine legate ai granuli di amido in
Ofanto e A431_4p1a a 36 DPA ...................................................................... 99
4.4 Analisi delle proteine solubili di Ofanto e A431_4p1a ....................................... 102
4.4.1 Analisi bidimensionale delle proteine solubili in Ofanto e A431_4p1a a
15 DPA .......................................................................................................... 102
4.4.2 Analisi bidimensionale delle proteine solubili in Ofanto e A431_4p1a a
36 DPA ........................................................................................................ 105
4.5 Confronto del proteoma delle linee transgeniche di Svevo ed Ofanto ................ 108
5 CONCLUSIONI ........................................................................................................ 112
6 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 116
RINGRAZIAMENTI .................................................................................................... 152
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ABSTRACT

The commercialization of genetically modified (GM) plants has raised several concerns
about the safety of derived food products, both in the scientific community that in the
media. In this PhD Thesis we have investigated the proteome of mature and immature
(15 DPA) kernels of durum wheat GM plants to evaluate the equivalence between
transgenic and untransformed lines. In particular a comparative study has been carried
out to analyze the proteome of two durum wheat transgenic lines obtained by two
methods of genetic transformation. 32 differentially expressed spots have been
identified in the granule bound and metabolic protein fraction of the transgenic line
MJ16-112 (obtained by biolistic method) and 37 spots in the transgenic line A431_4p1a
(obtained by Agrobacterium transformation). The differentially expressed proteins
identified can be regrouped in three classes: carbohydrates metabolism, defense
mechanisms and biosynthetic pathways of wheat kernel.
In conclusion the two transformation methods had similar secondary effects in both
protein fractions of the transgenic lines MJ16-112 and A431_4p1a.

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RIASSUNTO

L’introduzione in commercio di piante geneticamente modificate (GM), ha generato
diverse perplessità, sia nel mondo scientifico che a livello mediatico, sulla sicurezza
alimentare dei prodotti derivati. In questa Tesi è stato effettuato uno studio del proteoma
delle cariossidi di piante GM per valutare l’equivalenza tra le piante transgeniche e le
linee non trasformate. In particolare è stato condotto uno studio comparativo tra il
proteoma delle cariossidi mature e immature (15 DPA) di frumento duro di due linee
transgeniche ottenute con due metodi di trasformazione genetica.
Dalle analisi delle proteine estratte dai granuli di amido e della frazione metabolica sono
stati identificati 32 spot differenziamenti espressi tra la linea transgenica MJ16-112
(ottenuta mediante metodo biolistico) e la cultivar Svevo e 37 spot differenzialmente
espressi tra la linea transgenica A431_4p1a (ottenuta mediante trasformazione mediata
dall’Agrobatterio) e la cultivar Ofanto. Le proteine differenzialmente espresse
identificate possono essere raggruppate in tre grandi classi: metabolismo dei carboidrati,
meccanismi di difesa e processi biosintetici della cariosside di frumento.
In conclusione i due metodi di trasformazione hanno avuto effetti secondari simili in
entrambe le frazioni proteiche, e tali effetti non sembrano, quindi, influenzati dalle
diverse metodiche di trasformazione.

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