Análise da diversidade microbiana de grãos de kefir, caracterização da bebida fermentada e ...

237 Pages·2012·3.95 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS

Análise da diversidade microbiana de grãos de kefir, caracterização da bebida
fermentada e potencial probiótico das estirpes isoladas

Aluna: Analy Machado de Oliveira Leite
Orientadores: Vânia Margareth Flosi Paschoalin
Joab Trajano Silva
Co-orientador: Marco Antônio Lemos Miguel

Rio de Janeiro

2012
ANALY MACHADO DE OLIVEIRA LEITE

Análise da diversidade microbiana de grãos de kefir, caracterização da
bebida fermentada e potencial probiótico das estirpes isoladas

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciência de Alimentos.

Orientadores: Prof. Dra Vânia M. Flosi Paschoalin
Prof. Dr. Joab Trajano Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Lemos Miguel

Rio de Janeiro

2012
Leite, Analy Machado de Oliveira.
Análise da diversidade microbiana de grãos de kefir,
caracterização da bebida fermentada e potencial probiótico das
estirpes isoladas/ Analy Machado de Oliveira Leite - Rio de Janeiro:
UFRJ, 2012.
236 f.:

Orientadora: Vânia Margareth Flosi Paschoalin
Orientador: Joab Trajano Silva
Co-orientador: Marco Antônio Lemos Miguel
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Química, 2012.

1. Grãos de kefir 2. kefir 3.Comunidade microbiana 4.
Potencial probiótico – Teses. I.Paschoalin, Vânia M. Flosi
(Orient.). II. Silva, Joab Trajano. III Miguel,Marco Antonio
Lemos. IV Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto
de Química. Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos. V. Título.
Analy Machado de Oliveira Leite

Análise da diversidade microbiana de grãos de kefir, caracterização da bebida fermentada e potencial probiótico
das estirpes isoladas

Aprovada em

_______________________________________
(Vânia Margaret Flosi Paschoalin, Doutora – UFRJ/
Joab Trajano Silva, Doutor - UFRJ)

___________________________________________
(Marco Antônio Lemos Miguel, Doutor - UFRJ)

_________________________________________
(Selma Gomes Ferreira Leite, Doutora , UFRJ)

__________________________________________
(Raquel Regina Bonelli, Doutora - UFRJ)

__________________________________________
(Marcia Barreto Feijó, Doutora - UFF)

______________________________________________________
(Robson Maia Franco, Doutor – UFF)
Agradecimentos

A Deus, por me dar oportunidade de realizar este trabalho, proporcionar toda esta experiência
e estar sempre ao meu lado, guiando-me.

À minha família, em especial, minha mãe, por estar presente em todos os momentos, me
apoiando, incentivando, acreditando, comemorando cada conquista, como se fosse sua. Aos
meus tios Cleide e Renato que sempre estiveram próximos, me incentivando e apoiando. A
minha irmã, pela ajuda na revisão deste trabalho, por sempre torcer por mim e acreditar na
minha escolha. Ao meu pai que mesmo distante, sei que torce e se orgulha de mim. A minha
avó, que onde quer que esteja, estará sempre presente.

Aos meus orientadores, profa. Dra. Vânia Paschoalin e prof. Dr. Joab Trajano Silva, por
confiar em mim, apoiar minhas idéias e me dar à oportunidade de desenvolver este trabalho.
Obrigada pela paciência e disponibilidade da discussão dos resultados, pelo incentivo na
realização do doutorado sanduíche, pela orientação, dedicação nos momentos mais difíceis
desta tese e ótima convivência durante todos esses anos.

Ao meu co-orientador e amigo prof. Dr. Marco Miguel por sua companhia maravilhosa, por
estar sempre presente, por nossas longas conversas, por me fazer enxergar o mundo de uma
outra forma, pelos ensinamentos, por estar sempre disposto a ajudar, aconselhar, conversar,
apoiar, incentivar e discutir meus resultados.

À profa. Dra. Raquel Silva Peixoto e ao prof. Dr. Alexandre Soares Rosado por me receberem
e me acolherem no Laboratório de Ecologia Microbiana Molecular (LEMM), como se fosse
aluna do grupo. Obrigada por todo apoio, conversas, conselhos e oportunidade em adquirir
novas experiências.

Aos pesquisadores Dr. Baltasar Mayo e Dra. Susana Delgada pela oportunidade dada em
trabalhar no Instituto de Productos Lacteos de Asturias (IPLA), por todos os ensinamentos,
pelo apoio, pela atenção e ótima recepção na Espanha.
A todos da Faculdade de Farmácia da UFF, especialmente do Departamento de Bromatologia
de Alimentos, pela ótima convivência durante o meu contrato de professor Substituto, por
apoiarem e incentivarem o meu estágio sanduíche na Espanha.

Ao prof. Dr. Sergio Seabra, ao técnico Eliandro Lima e ao aluno Laidson Paes Gomes pela
ajuda técnica e apoio nas análise de Microscopia Eletrônica de Varredura dos grãos.

A todos os amigos do laboratório 545, novos e antigos Eduardo Eustáquio, Bruna Bellei,
Giselli Asensi, Laidson Paes (Antunes), Patricia, Fernanda Pinhati, Luciana, Raquel, Thiago
Alvarez, Sabrina, Filipe, Felipe, Tiyoko, Karine, Carlos, Nathalia, Ana Letícia, Rodrigo, Ana
Carolina, Claudius, ao técnico Ricardo Bretas e ao primo Rafael Luiz por conviverem comigo
durante todos esses anos da melhor forma possível, pelas trocas de informações, pelas
conversas, desabafos, almoços, experimentos, por me apoiarem e me ouvirem nos momentos
difíceis. À minha querida aluna de iniciação científica Bianca Fernandes Arruda, por me
ajudar nos momentos mais estressantes deste trabalho, por estar sempre disposta a ajudar,
contribuindo em grande parte dos resultados. Ao Dr. Eduardo Mere por toda paciência, por
todas as brigas, momentos de descontração, orientação, discussões, correções e ajuda.

Aos amigos do laboratório de Microbiologia de Alimentos, Renata, Priscila, Leonisa, Carol,
Marcela, Juliana, Aline, Bia, Duda, Ana, Henrique, Max, Tayná por toda ajuda, carinho,
almoços, conversas, e ótima convivência durante todos esses anos. Em especial ao técnico
Antonio por toda disponibilidade, paciência, apoio, carinho, ensinamentos e ajuda nos meus
experimentos.

Aos amigos do LEMM pela recepção, por todas as conversas, almoços, churrascos,
aprendizado e companheirismo. Em especial gostaria de agradecer a minha prima postiça
Deborah Leite por sua disposição em me ajudar desde o início, por sua simpatia, sua
dignidade, pelos experimentos, idéias, discussão dos resultados, carinho e apoio em todos os
momentos. Ao aluno Caio Rachid por toda paciência, por todo apoio, conversas,
ensinamentos, ajudas nos experimentos e análises bioinformática, pelas discussões dos
resultados e por todos os ótimos momentos de convivência. A Regina Macedo por suas sábias
palavras nos momentos mais desesperadores, a Luiza Lessa por sua companhia maravilhosa e
pela amizade construída em tão pouco tempo.
A todos do IPLA pela recepção maravilhosa, por toda convivência nos sete meses na
Espanha, por toda preocupação, por me deixarem tão à vontade, por toda atenção e
companhia. Em especial a técnica Alicia Noriega pela amizade, companheirismo, pelos
jantares, calimochos, saídas, conversas e ajudas nos experimentos. Aos alunos Luca Losurdo,
Marutpong Panya, Ángel Alegría, Elena Fernandes pela ótima convivência no laboratório e
pela ajuda, amizade e paciência.

A todas as minhas amigas maravilhosas Fernanda Vasconcellos, Nádia Vidal, Daniele Fasano,
Manuela Dias, Bruna Bellei, Giselli Asensi, Thaiz Rangel, Patrícia Baptista, Daniela Catarina,
Ana Vater, Erica Castro, Veronica Catão, Thais Lin, Flavia Sousa, Clara Slade e Juliana Sá
que estiveram sempre ao meu lado, me apoiando e incentivando. Em especial, à Luciana
Romão, por todos os conselhos, conversas, ajudas e revisões, sempre com muita dedicação e
boa vontade.

A Capes pela bolsa de doutorado e doutorado sanduíche concedida (BEX 5019/10-9).

Ao CNPq e FAPERJ pela apoio financeiro.

A todos que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho. Muito obrigada!!
“Tu te tornas eternamente responsável
por aquilo que cativas”

“Mas o vaidoso não ouviu.
Os vaidosos só ouvem os elogios”

O Pequeno Príncipe
Antoine de Saint Exùpèry
LEITE, Analy Machado de Oliveira. ANÁLISE DA DIVERSIDADE MICROBIANA DE
GRÃOS DE KEFIR, CARACTERIZAÇÃO DA BEBIDA FERMENTADA E POTENCIAL
PROBIÓTICO DAS ESTIRPES ISOLADAS. Rio de Janeiro, 2012. Tese (Doutorado em
Ciência de Alimentos) - Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2012

Resumo

Kefir é uma bebida láctea fermentada por uma comunidade microbiana mista presente no grão
de kefir. A microbiota de grãos brasileiros e da bebida fermentada foi analisada por PCR-
DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), pirosequenciamento, e ARDRA (amplified
ribosomal DNA restriction analysis); os metabólitos da fermentação foram analisados por
cromatografia líquida de alta eficiência; além da avaliação do potencial probiótico das cepas
isoladas. Lactobacillus kefiranofaciens, L. kefiri e Saccharomyces cerevisiae foram
encontradas majoritariamente em todos os grãos. Membros do gênero Lactobacillus
totalizaram 96% das espécies bacterianas, ao contrário de Lactococcus spp, Leuconostoc spp,
e Acetobacter spp, presentes em baixos níveis. Na bebida fermentada (24 h), Bactérias Ácido
Láticas (BAL), Bactérias Ácido Acéticas (BAA) e leveduras foram encontradas em 10, 7,8 e 6
log de UFC/mL, respectivamente. Durante a estocagem do kefir (28 dias/4°C), as contagens
de BAL e leveduras mantiveram-se constante, mas a contagem de BAA foi reduzida para 7,2
log UFC/mL. Os isolados do kefir foram identificados como L. lactis cremoris (45%), L.
lactis lactis (5%), L. mesenteroides (29%), A. lovaniensis (10%) e S. cerevisiae (11%).
Entretanto, as espécies predominantes identificadas a partir do sequenciamento das bandas
isoladas do PCR-DGGE foram L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. parakefiri e S. cerevisiae,
indicando que a combinação de técnicas independentes e dependentes de cultivo foi
importante para a completa caracterização da microbiota. Durante a fermentação e estocagem
do kefir o pH (6,55-4,31), o teor de lactose (46,3/8,4 mg/mL) e ácido cítrico (4,18/2,89
mg/mL) foram reduzidos, enquanto que glicose (0,18/0,37 mg/mL), galactose (0,46/0,88
mg/mL), ácidos lático (0/9,53 mg/mL), acético (0/1,15 mg/mL), butírico (0/0,63 mg/mL),
propiônico (0,44/0,96 mg/mL) e etanol (0/1,36 mg/mL) foram aumentados. 33 BAL isoladas
dos grãos e classificadas como L. mesenteroides (52%), L. casei/paracasei (15%), L. lactis
lactis (9%) e L. lactis cremoris (24%) foram tolerantes ao pH ácido e a sais biliares, capazes
de inibir a proliferação de patógenos, sem apresentar atividade hemolítica ou enzimática
indesejável, e foram sensíveis à maioria dos antibióticos testados. Cinco isolados produziram
bacteriocinas e dois foram capazes de aderir às células Caco-2 de forma comparável ao
controle. Sendo assim, duas cepas de L. casei/paracasei mostraram-se adequadas para uso
como probiótico.

Palavras-chave: grãos de kefir, kefir, comunidade microbiana, potencial probiótico
LEITE, Analy Machado de Oliveira. MICROBIAL DIVERSITY ANALYSIS OF KEFIR
GRAINS, CHARACTERIZATION OF THE FERMENTED BEVERAGE AND
PROBIOTIC POTENTIAL OF ISOLATED STRAINS. Rio de Janeiro, 2012. Thesis
(Doctorate in Food Science) – Chemistry Institute, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, 2012

Abstract

Kefir is a milk beverage fermented by a mixed microbial community found in kefir grains.
The microbiota of Brazilian grains and the fermented beverage were assessed by PCR-DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis), pyrosequencing, and ARDRA (amplified ribosomal
DNA restriction analysis); fermentation metabolites were analyzed by high performance
liquid chromatography, and the evaluation of the probiotic potential of isolated strains was
conducted. Lactobacillus kefiranofaciens, L. kefiri and Saccharomyces cerevisiae were the
predominant species found in all grains. Members of the Lactobacillus genus amounted to
96% of the bacterial species, while Lactococcus spp, Leuconostoc spp and Acetobacter spp
were present in low levels. In the fermented beverage (fermented for 24 h), lactic acid bacteria
(LAB), acetic acid bacteria (AAB) and yeast were found in 10, 7.8 and 6 log CFU/ml,
respectively. During kefir storage (28 days at 4 °C), the LAB and yeast counts remained
constant, but the BAA count was reduced to 7.2 log CFU/ml. The isolated strains were
identified as L. lactis cremoris (45%), L. lactis lactis (5%), L. mesenteroides (29%), A.
lovaniensis (10%) and S. cerevisiae (11%). However, the predominant species identified by
DGGE band sequencing were L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. parakefiri and S. cerevisiae,
indicating that the application of a polyphasic approach, using culture-dependent and -
independent techniques, was important for a complete microbiota characterization. During
fermentation and kefir storage pH (6.55 to 4.31), lactose (46.3 - 8.4 mg / ml) and citric acid
(4.18 - 2.89 mg / ml) content were reduced, while glucose (0.18 - 0.37 mg / mL), galactose
(0.46 - 0.88 mg / ml), lactic (0/9, 53 mg / ml), acetic (0.00 -1.15 mg / ml), butyric (0.00 - 0, 63
mg / ml) and propionic acids (0.44 / 0.96 mg / ml) and ethanol (0.00 - 1.36 mg / ml) were
increased. 33 LAB isolated from kefir grains and identified as L. mesenteroides (52%), L.
casei / paracasei (15%), L. lactis lactis (9%) and L. lactis cremoris (24%) were tolerant to
acidic pH and bile salts, capable of inhibiting pathogen proliferation without introducing
undesirable hemolytic or enzyme activity and were sensitive to most of the tested antibiotics.
Five isolates produced bacteriocins and two were able to adhere to the Caco-2 cells in a
manner comparable to the control. Thus, two L. casei/paracasei strains proved suitable for
use as probiotics.

Keywords: Kefir grains, kefir, microbial community, probiotic potential.