Ana Paula Amaral de Brito Efeito... 2015 PDF
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISA GONÇALO MONIZ Curso de Pós-Graduação em Patologia TESE DE DOUTORADO EFEITO DOS EXTRATOS DE VALERIANA OFFICINALIS NA CITOTOXICIDADE DA ROTENONA IN VITRO E NA DEPRESSÃO ALASTRANTE CORTICAL IN VIVO ANA PAULA AMARAL DE BRITO Salvador – Bahia 2015 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE MEDICINA FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ CENTRO DE PESQUISA GONÇALO MONIZ Curso de Pós-Graduação em Patologia TESE DE DOUTORADO EFEITO DOS EXTRATOS DE VALERIANA OFFICINALIS NA CITOTOXICIDADE DA ROTENONA IN VITRO E NA DEPRESSÃO ALASTRANTE CORTICAL IN VIVO ANA PAULA AMARAL DE BRITO Orientador: Dr. Ramon Dos Santos El-Bachá Co-Orientador: Dr. Rubem Carlos Araújo Guedes Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em Patologia Humana, para obtenção de grau Doutor. Salvador – Bahia 2015 Dedico este trabalho a todos aqueles que acreditaram em mim, e que me incentivaram a continuar na busca no saber. AGRADECIMENTOS Ao Supremo Criador, o maior responsável pela concretização deste sonho, e por ser Ele o Deus do Impossível, transpondo os empecilhos quando me pareciam intransponíveis; Aos meus pais, Francisco e Cândida, pessoas admiráveis, integras, batalhadoras, em quem me espelho e a quem devo a minha vida! A eles, o meu eterno reconhecimento pela dedicação e carinho, renúncia e, acima de tudo, AMOR!!!; A Benício Júnior, presente de Deus na minha vida, pelo carinho, apoio, paciência, companheirismo, e pelos momentos mais felizes da minha vida; Ao meu orientador, Professor Ramon dos Santos El-Bachá pelo auxílio no desempenho de minhas tarefas no LabNq da UFBA, por toda dedicação, paciência; Ao meu co-orientador, Professor Rubem Carlos Araújo Guedes, que sempre foi muito mais que um mestre, mas um verdadeiro amigo e pai para seus alunos; Aos meus irmãos, Ana Carla e Francisco Júnior, pelo amor que nos une e os muitos momentos de paciência, de compreensão e solidariedade; A minha sobrinha Mel, por iluminar os nossos dias simplesmente com a sua inocência de criança; A minha vó Cecília, por sempre encorajar-me a percorrer os caminhos que me levaram à vitória que conquistei; Aos meus queridos sogros, Seu Benício e Dona Vera, e minha cunhada Gina, pela convivência e carinho com que me receberam; Aos amigos da turma do Doutorado, em especial Eli, e Nadja, pelos estudos em conjunto e pelo companheirismo; A Pietro pelo compartilhamento dos assuntos relacionados aos nossos projetos de pesquisas e pelo companheirismo entre amigos; Aos amigos do LabNq, Diêgo, Rute, Liz, e Vanessa, que contribuíram para a realização do projeto; Aos meus amigos do LAFINNT/UFPE, Suzane, Vanina, Manu, Denise, Nora, Isabel Michele, que contribuíram para os experimentos realizados na UFPE, e que ao longo desses anos, mesmo com a distância se fizeram presente; Ao Prof Martins, sempre dispostos a solucionar minhas dúvidas e contribuir para o enriquecimento do trabalho; A todos que compõem o LabNq/UFBA, e LAFINNT/UFPE (professores, secretaria, estagiários, mestrandos e doutorandos) muitíssimo obrigado pela assistência e amizade; Ao veterinário Edeones França e ao Sr. Zé, pelo prestimoso trabalho realizado respectivamente no Biotério do Departamento de Nutrição/UFPE, e Biotério do ICS/UFBA; Aos funcionários da Biblioteca do CPqGM / FIOCRUZ, especialmente a Ana Fiscina Sampaio, pela organização das referências bibliográficas; À Capes e ao CNPq pelo financiamento desse estudo; Aos demais professores, e a todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a que este trabalho fosse concretizado, que sempre acreditaram em mim. “... mestre não é aquele que ensina, mas aquele que, de repente, aprende!” Vaqueiro Manoel Grande Sertão: Veredas Guimarães Rosa BRITO, Ana Paula Amaral de. Efeito dos extratos de valeriana officinalis na citotoxicidade da rotenona in vitro e na depressão alastrante cortical in vivo. 76 f. il. Tese (Doutorado em Patologia) – Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Salvador, 2015. RESUMO Os astrócitos são o tipo celular mais numeroso no sistema nervoso central (SNC). Eles exercem suporte estrutural, trófico, e metabólico para neurônios e modulam a atividade sináptica. Então, o prejuízo nestas funções dos astrócitos pode influenciar na sobrevivência dos neurônios. De fato, numerosas evidências têm descrito a influência dos astrócitos no desenvolvimento de uma variedade de doenças neurodegenerativas. Neurotoxinas ambientais como rotenona, um inibidor específico do complexo I mitocondrial, provêem modelos de doenças neurodegenerativas tanto in vivo quanto in vitro. Sendo assim, a busca de novas substâncias com atividade neuroprotetora é atualmente o foco de estudos, e uma tendência crescente tem sido direcionada para plantas medicinais. Neste trabalho investigou-se a influência do extrato aquoso de Valeriana officinalis (V. officinalis) e da rotenona sobre os aspectos eletrofisiológicos do funcionamento cerebral, e o efeito citoprotetor dos extratos com éter de petróleo (PE) e metanol (MeOH) de V. Officinalis contra a toxicidade induzida pela rotenona. O estudo adotou uma abordagem que associa técnicas químicas, celulares e eletrofisiológicas. Ratos machos albinos, Wistar, adultos, em condições normais de nutrição, foram divididos em: grupo valeriana, tratados, por gavagem, com extrato aquoso de valeriana (250 mg/kg/dias) durante 15 dias; grupo rotenona, tratados, por via subcutânea, com rotenona (10 mg/kg) durante 7 dias; grupo valeriana + rotenona, submetidos a ambos tratamentos. Os respectivos controles foram igualmente tratados com solução salina ou solução de 1% de Tween-80 em água. Após o período de tratamento, os animais foram anestesiados, submetidos à trepanação seguida do registro da depressão alastrante cortical (DAC), na superfície do córtex cerebral, por 4 horas. Para avaliação da citoxicidade da rotenona e da atividade citoprotetora dos extratos de V. officinalis foram realizadas análises de viabilidade celular através da redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) e visualização por microscopia de contraste de fase em células de glioma murino (C6) e humano (GL-15), além de astrócitos de rato como controle de células normais. Os animais tratados com rotenona apresentaram redução da velocidade de propagação DAC enquanto que os animais tratados com valeriana apresentaram um aumento da velocidade de propagação. No entanto, os animais tratados com rotenona e valeriana não apresentaram diferença estatística na velocidade de propagação da DAC quando comparado aos grupos controles. Os resultados demonstraram que a rotenona foi citotóxica nas linhagens testadas, reduzindo a viabilidade e alterando a morfologia celular de maneira dose-dependente. Os extratos de PE e MeOH de V. officinalis foram efetivos em aumentar a viabilidade celular, bem como reduzir as alterações morfológicas induzidas pela rotenona nas linhagens celulares testadas. A análise do RMN 1H dos extratos de V. Officinalis demonstrou a presença de substâncias terpenoides; esse resultado relaciona os efeitos de V. Officinalis a ação antioxidante. O extrato aquoso de V. Officinalis preveniu as alterações eletrofisiológicas induzidas pela rotenona. Os resultados corroboram com estudos pregressos que descrevem os extratos de V. officinalis com função citoprotetora, deixando esse composto muito mais próximo de testes que venham a confirmar sua efetividade em diversas modalidades terapêuticas. Palavras-chave: Rotenona, Estresse oxidativo, Valeriana Officinalis, Citoproteção, Depressão Alastrante Cortical, Anticonvulsivante. BRITO, Ana Paula Amaral de. Effect of valeriana officinalis extracts on rotenone induced- citotoxity in vitro and in the cortical spreading depression in vivo. 76 f. il. Tese (Doutorado em Patologia) – Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Salvador, 2015. ABSTRACT Astrocytes are the most numerous cell type in the central nervous system (CNS). They provide structural, trophic and metabolic support to neurons, and they modulate synaptic activity. Accordingly, impairment in these astrocyte functions can critically influence neuron survival. Indeed, several evidences have presented the influence of astrocytes for the development of a variety of neurodegenerative disorders. Environmental neurotoxins such as rotenone, a specific inhibitor of mitochondrial complex I that generates reactive oxygen species (ROS), provide models of neurodegenerative disorders both in vivo and in vitro. Thus, the search for new substances with neuroprotective activity is currently the focus of studies, and a growing trend has been directed at medicinal plants. In this study, we investigated the influence of of Valeriana officinalis (V. officinalis) and rotenone in the brain function through neurophysiological aspects, and the citoprotective effect of petroleum ether (PE) and methanol (MeOH) extracts of V. officinalis against rotenone-induced toxicity. The study adopted an approach that combines chemical, cellular and eletrophisiological techniques. Wistar male rats (adults), in normal conditions of nutrition, were divided in: valerian group, treated by gavage, for 15 days, with 250 mg/kg/day of the aqueous extract of V. officinalis; rotenone group, treated with s.c. injections at the daily dose of 10 mg/kg for 7 days; rotenone + valerian group treated with both substances. The control groups were treated equally with saline solution or 1% Tween-80 solution in water. After the treatment period, the cortical spreading depression (CSD) was recorded for 4 h at 2 cortical points in the parietal region. In order to investigate the rotenone-induced citotoxicity and the antioxidant activity of V. officinalis extracts, cell viability assays were performed through the reduction of 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), and visualization by phase contrast microscopy in rat glioma C6 cells and human glioblastoma GL-15 cells, as well as in rat astrocytes for comparison. The rotenone treated-animals presented lower mean CSD velocities, whereas CSD velocities were higher in the valerian-treated animals. When compared to the control animals, the treatment with rotenone plus valerian revealed no significant difference. The results demonstrated that rotenone was cytotoxic in the cell lines tested, reducing the cell viability and changing the cell morphology in a dose-dependent manner. The PE and MeOH extracts of V. officinalis were effective in increase cell ciability and reduce the rotenone-induced morphological changes in the tested cell lines. The 1H NMR analysis of V. Officinalis extracts showed the presence of terpenoid substances; this result relates the effects of V. Officinalis antioxidant action. The results corroborate previous studies describing the V. officinalis extracts with cytoprotective function, leaving the compound much closer to tests that will confirm their effectiveness in various therapeutic modalities. Key words: Rotenone, Oxidative stress, Valeriana Officinalis, Cytoprotective, Cortical Spreading Depression, Aonticonvulsivant. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química do tripeptídeo glutation, mostrando os seus aminoácidos constituintes e evidenciando o grupo sulfidrila (-SH)..............................................16 Figura 2. À esquerda, esquema (adaptado de Leão e Martins-Ferreira, 1953), mostrando a seqüência temporal cíclica de eventos da depressão alastrante cortical...................20 Figura 3. Fórmula estrutural da rotenona..................................................................................25 Figura 4. Via bioquímica da formação de rotenona..................................................................26 Figura 5. Estrutura química de isovaleramida (3-metil-butanamida), constituinte químicos da V. Officinalis.............................................................................................................28 Figura 6. Pesos corporais (média + erro padrão) em gramas de ratos wistar....................................................................................................................... 41 Figura 7. Registros eletrofisiológicos (variação lenta de voltagem, P) da DAC..................... 42 Figura 8. Velocidades de propagação da DAC em ratos de 65-75 dias................................... 43 Figura 9. Viabilidade celular avaliada pelo teste do MTT após tratamento com rotenona em concentrações crescentes..........................................................................................45 Figura 10. Viabilidade celular avaliada pelo teste do MTT em células GL-15 e C6 após tratamento com extratos PE e MeOH de V. officinalis.............................................47 Figura 11. Viabilidade celular avaliada pelo teste do MTT em células GL-15 e C6 após tratamento simultâneo de rotenona a concentrações de 13,42 nM (GL-15) e 3,5 nM (C6) com os extratos PE e MeOH de V. officinalis..................................................49 Figura 12. Análise por microscopia de contraste de fase das células Gl-15 tratadas por 48 horas com DMSO 0,5%............................................................................................50 Figura 13. Espectro de RMN 1H do extrato PE de V. Officinalis.............................................51 Figura 14. Espectro de RMN 1H do extrato MeOH de V. Officinalis.......................................52
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