Ana del Pozo Rodríguez

299 Pages·2009·12.23 MB·English

DESARROLLO DE NANOPARTÍCULAS SÓLIDAS
LIPÍDICAS COMO SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN
DE ADN PARA TERAPIA GÉNICA

AAAANNNNAAAA DDDDEEEELLLL PPPPOOOOZZZZOOOO RRRROOOODDDDRRRRÍÍÍÍGGGGUUUUEEEEZZZZ
Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farmacéutica
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea

Facultad de Farmacia, Vitoria-Gasteiz, 2009
AGRADECIMIENTOS

La mayoría de los que lean las palabras que vienen a continuación sabrán la
dedicación que requiere la investigación y las horas de trabajo que hacen falta para ver
finalizada la tesis. Todo ese esfuerzo se ve recompensado con la posibilidad de trabajar
en aquello con lo que disfrutamos, pero el apoyo y amistad de los que están cerca
nuestro es imprescindible para hacerlo más llevadero. Por eso, quiero dedicarles aquí
unas palabras de agradecimiento.
En primer lugar quiero dar las gracias a mi familia, porque sin vuestro apoyo y
confianza no hubiera podido dedicarme a esto. A mis padres, Simón y Espe, por el
esfuerzo empeñado en mi educación, por darme mucho más de lo que me ha hecho
falta. A mi hermana Nuria y a mi tía Pili, por estar siempre pendientes de lo que hago,
por alegraros con mis alegrías y entender mis agobios. Antonio, gracias por tu cariño, por
tu paciencia y compresión cuando el trabajo ocupa demasiado tiempo, por darme
tranquilidad y por ayudarme a desconectar en el tiempo libre.
Quiero agradecer a Jose Luís Pedraz su dirección en esta tesis, el haberme permitido
formar parte de su grupo de investigación hace ya unos años y seguir mostrando su
confianza en mí con el paso del tiempo.
Alicia Rodríguez y Marian Solinís, gracias por vuestra implicación en la dirección de
esta tesis. Alicia, sé el esfuerzo que has realizado, poniendo siempre buena cara ante
los imprevistos y animándome en todo momento. Marian, gracias por tu comprensión,
cercanía y amistad. Me siento afortunada de trabajar a vuestro lado, por todo lo que me
enseñáis a nivel laboral pero sobre todo en lo personal.
Diego, tenerte como compañero de trabajo es un placer, por tu ayuda desinteresada,
por hacer que el trabajo sea agradable y divertido, por los ratos fuera del laboratorio y
porque con todo ello consigues que trabajar contigo sea muy fácil. Sin tu colaboración y
amistad hubiese sido muy difícil sacar adelante esta tesis.
Lourdes y Leire, la amistad surgida a lo largo de estos cinco años hace más
llevaderos los días duros. Gracias por los ánimos y por los ratos de risas y confidencias,
que espero que no se pierdan.
Arantxa Isla, Noe y Zuri, gracias por vuestra disponibilidad, consejos y
conversaciones, que poco a poco se han hecho imprescindibles.
Ainhoa y Elena, vuestra amistad y vuestra preocupación por todas aquellas cosas que
el resto damos por hechas hacen mucho más agradable el trabajo.
Edorta, con tu “locura” particular haces esto más divertido. Aitziber, gracias por
interesarte por este trabajo.
Sara, gracias por ayudarme en los comienzos con las células, y por mantener el
contacto. Gorka y María, parte de lo que sé de cultivo celular lo he aprendido de
vosotros.
A Amaia, Jon, Rosa y Manoli, al resto de profesores, y como no, al resto de
compañeros del departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, gracias por
hacerme sentir siempre arropada.
Al departamento de Zoología y Biología Celular Animal, por permitirme usar su
equipamiento.
A Ernest Giralt y Silvia Pujals del Instituto de Investigación Biomédica de Barcelona,
gracias por vuestra confianza, disponibilidad y esfuerzo.
A Juanma y Enrique del Departamento de Fisiología, y a Gontzal del Departamento
de Neurociencias por vuestra ayuda desinteresada con las muestras del ensayo “in vivo”.
Al Servicio General de Microscopía Analítica y de Alta Resolución en Biomedicina
(perteneciente a los Servicios Generales de Investigación de la Universidad del País
Vasco) por el soporte técnico en microscopía confocal; especialmente a Ricardo, por tu
empeño y paciencia.
Por supuesto, quiero dar también las gracias a mis amigos, especialmente a Lucía y
Nuria por todos los años de amistad y por todo lo compartido, por preguntar qué tal va
todo aunque en el fondo no entendáis muy bien el trabajo que realizo.

MUCHAS GRACIAS
La ignorancia afirma o niega
rotundamente; la ciencia duda
Voltaire
GLOSARIO
a -1AT: a 1-antitripsina
a -Gal A: a -galactosidasa A
ADA: enzima adenosin-desaminasa
ADN: ácido desoxirribonucleico
AFM: microscopía de fuerza atómica
ARN: ácido ribonucleico
ARPE-19: células humanas del epitelio pigmentario de retina
ATCC: colección de células americana
BDNF: factor neurotrofico derivado del cerebro
CAT: enzima cloranfenicol transferasa
CD: citosina desaminasa
CFTR: proteína reguladora de conductancia transmembrana
CLSM: microscopía láser confocal
CPP: péptido de penetración celular
CsCl: cloruro de cesio
dATP: desoxiATP
D-MEM: medio de cultivo Dulbecco’s Modified Tagle
DNA: ácido desoxirribonucleico
DNasa: enzima desoxirribonucleasa
DNase: enzima desoxirribonucleasa
DOPE: dioleoil-fosfatidiletanolamina
DOTAP: N-[1-(2,3-Dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
EMA: monoazida de etidio
EMEM: medio de cultivo Eagle’s Minimal Essential
F12: Mezcla de nutrientes de Han para medio de cultivo
GAD: descarboxilasa glutámica ácida
GAG: glucosaminoglucanos
Gb3: globotriosilceramida
GDNF: factor neurotrófico derivado de células de la glia
GFP o EGFP: proteína verde fluorescente
HEK293: células humanas de riñón embrionario
HeLa: línea celular de adenocarcinoma de cérvix
H.R.: humedad relativa
HSV-tk/GCV: sistema de la timidina quinasa del herpes simplex/ganciclovir
IFN-a 2: interferón a 2
IL2: interleukina 2
L-DNA o L-ADN: ADN lineal
LDV: velocimetría láser Doppler
n: número de replicados
NaCl: cloruro sódico
NGF: factor de crecimiento nervioso
NK: células natural killer
NLS: señal de localización nuclear
NPC: complejo de poros nucleares
OC-DNA u OC-ADN: ADN abierto circular
pADN: ADN plasmídico
PCS: espectroscopía de correlación fotónica
PEG: polietilenglicol
PEI: polietilenimina
pHPMA: poli(N-2-hidroxipropil)metacrilamida
PLGA: ácido poli-láctico co-glicólico
PLL: poli(L-lisina)
PVDF: polifluoruro de vinildeno
RES: sistema retículo endotelial
RGD: secuencia arginina-glicina-ácido aspártico
R.H.: humedad relativa
RNA: ácido ribonucleico
RPE: epitelio pigmentario de retina
RS1: gen de las retinosquisis juvenil ligada al sexo
SAP: Péptido “Sweet Arrow”
SC-DNA o SC-ADN: ADN superenrollado
SCDI: inmunodeficiencia severa combinada
SD: desviación estándar
SDS: laurilsulfato sódico
SIDA: síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida
SLNs: nanopartículas sólidas lipídicas
SRE: sistema reticuloendotelial
Tat: trans-activador de la transcripción
Tg: temperatura de transición vítrea
VEGF: factor de crecimiento del endotelio vascular
Vif: factor de infectividad viral
VIH: virus de la inmunodeficiencia humana
VLPs: partículas similares a virus
VP22: proteasa viral del virus herpes simplex
X-SCID: inmunodeficiencia severa combinada ligada al cromosoma X
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN 1
I. Clasificación de la terapia génica 5
1.1. Tipos de terapia génica en función de la célula diana 7
1.1.1. Terapia génica de células germinales 7
1.1.2. Terapia génica de células somáticas 8
1.2. Tipos de terapia génica en función de la estrategia a seguir
8
1.2.1. Terapia génica “ex vivo” 8
1.2.2. Terapia génica “in vivo” 9
II. Técnicas de administración de ADN 11
2.1. Sistemas físicos 13
2.2. Sistemas virales de administración de ADN 15
2.3. Sistemas químicos de administración de ADN 18
III. Transferencia génica con sistemas no virales 25
3.1. Distribución del ADN en el organismo 28
3.2. Fijación a la superficie celular 34
3.3. Entrada en el citoplasma 37
3.4. Escape endosomal del ADN al citoplasma 39
3.5. Entrada del ADN en el núcleo 40
IV. Aplicaciones de la terapia génica 43
4.1. Aplicación de la terapia génica al tratamiento de
enfermedades monogénicas 45
4.1.1. Fibrosis quísitica 46
4.1.2. Hemofilia 47
4.1.3. Inmunodeficiencia severa combinada (SCID) 48
4.1.4. Retinopatías 52
4.1.5. Enfermedad de Fabry 55
4.1.6. Distrofia muscular de Duchenne 56
4.2. Aplicación de la terapia génica al tratamiento de
enfermedades adquiridas 57
4.2.1. Cáncer 57
4.2.2. SIDA 62
4.2.3. Enfermedades neurodegenerativas 66
OBJETIVOS 69
DESARROLLO EXPERIMENTAL 73