Alexandre SALSMANN Étude fonctionnelle de la signalisation intracellulaire médiée par l'intégrine

239 Pages·2009·39.15 MB·English

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U.f.R. : Sciences & Techniques Biologiques
École Doctorale: Biologie-Santé-Environnement
Thèse
présentée pour l'obtention du titre de
Docteur de l'Université Henri Poincaré, NANCY 1
en Biologie Moléculaire et Cellulaire
PAR
Alexandre SALSMANN
Étude fonctionnelle de la signalisation intracellulaire
médiée par l'intégrine au cours de l'interaction
allbf33
avec le fibrinogène immobilisé
présentée etsoutenue publiquement le lundi 23 Janvier2006
PrésidentduJury: M. Michel Dauça, Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy1
Rapporteurs : Mme EllenVanObberghen-Schilling. Docteur, CNRS-UMR6543, Nice
M. Bernard Payrastre, Docteur. INSERM U563.Toulouse
Examinateurs : MmeMoniqueAumailley, Professeur, Institutde Biochimie, Cologne
M. François Lanza, Docteur. INSERM U311, Strasbourg
DirecteurdeThèse: MmeNelly Kieffer, Professeur, Universitédu Luxembourg
Laboratoire de Biologie et Physiologie Intégrée(CNRS/GDRE-ITI)
Université du Luxembourg
Je vowirais e:K[Jnmerma profonâe reconnaissance à mon âirecteurâe tfièse
1vtaâame (e Professeur :Ne(ry 1(ieffer qui m'a cfia(eureusement accuei((i
âans son équipe âe recfiercfie et qui m'a soutenu tout au (ong âe ces années
âe travaiL 1vtercipourCa confiance âont vous avez témoigné.
Je suis tout particuCièrement reconnaissant envers 1vtonsieur 1vticfie(
CDauça, mon professeur tout au Cong âe mon cursus à (,Vniversité âe
:Nancy, qui m'a pennis âe pCongerâans ce monâe âe Ca 6ioCogie ce((uCaire et
qui a acceptéâe présiâer(ejury âe ma tfièse.
J'e:K[Jnme ma profonâe gratituâe à 1vtaâame Œ,[(en 'Van 066ergfien
Scfii(Cing et à 1vtonsieur Œernarâ Payrastre qui ont 6ien vou(u juger ce
travai( en tant que rapporteurs. Je Ces remercie vivement pour ('intérêt
qu'ifs ontporté à ce travaiL
J'aimerais e:K[Jnmer ma reconnaissance à 1vtaâame 1vtonique }lumai(Cey et
1vtonsieurPrançois Lanza qui ont accepté âefaire partie âujury.
Je remercie très sincèrement 1vtaâame çrete(Lutfie et 1vtaâame 1vtonique
}lumai((ey pour (eur accuei( à Corogne et (eurs généreu:{. conseifs
concernant (es e:K[Jénences âe pu({({own.
J'aâresse âe cfia(eureu:{. remerciements à 1vtaâame CDominique Œarucfi,
1vtaâame PauCette Legenâre, 1vtonsieurJean-ŒernarâCJ\fgnoufâe 'Vains et
1vtonsieur 1vticfie( Œois6run pour (eurs co(Ca6orations scientifiques
fructueuses.
J'adresse mes remerciements au ?r1inistère de {a Cufture, de
C!Enseignement Supérieur et de {a ~clierclie pour son soutien financier
sans feque{ ce travai{ n'aurait jamais vu {e jour, ainsi qu'au Ponds
:Nationa{de fa ~clierclie du L~m6ourg pourson soutienfinancierpour
Cimpression du manuscrit.
'Un grand?r1erci à tous fes mem6res du fa6oratoire qui ont travai[fé à mes
côtés, et qui ont su me consei{fer, m'aideret m'encouragerpendant tout ce
temps: ?rtartine, ?rticlièfe, Sandra, Sopliie, Cliristine, (])anije{a, Patric~
Cliantaf, Cliristiane, Stéplianie, Pa6rice, Laurent, Sé6astien.
Je souliaite eJ\Primer ma p{us profonde reconnaissance à Lis scliajfner
~ckingerqui a su m'encadrer dès mon arrivée au fa6oratoire et qui m'a
accompagné tout au {ong de ce travai{ avec tant de compétences et de
conviviafité. ?rtercipourtes encouragements et ton e::{j;rèmegenti{{esse.
Je tiens égarement à remercier très cliafeureusement ?rte[qui a toujours été
Cà pour me soutenir au cours de ces années et avec quije partage tant de
60ns moments depuis mon arrivée à L~m6ourg. 'Un grandmerci aussi à
tous mes amis qui, par feur présence continue, m'ont soutenu morafement
et ont contri6ué au 60n déroufement de cette tlièse à {eurmanière. Je pense
notamment à ~n, Ofiv, Cami[fe, Pa6, (])ove, ?rtiscli, Cindy, à mes amis de
Pac et a14.Poissons c.R.çuges.
J'aimerais fina{ement remercier très sincèrement Jennie pour m'avoir
soutenu, encouragé et réconforté avec une disponi6ifité, une 60nne liumeur
et un amourà toute épreuve.
!Enfin, je voudrais remercier du fond du coeur et dédier cette tlièse à ma
soeur, à mes parents, ainsi qu'à mes grands-parents pour {eur
e::{j;raordinaire soutien dontj'aipu 6énificierà cliaque instant.
RÉSUMÉ
L'intégrine Ullb~3 des plaquettes, principal récepteur du fibrinogène, joue un
rôle prépondérant dans l'adhésion et l'agrégation plaquettaires, en établissant un lien
physique et dynamique entre le fibrinogène sanguin et les protéines plaquettaires
intracellulaires de la signalisation et du cytosquelette. Le processus de reconnaissance
du fibrinogène par l'intégrine CXllb~3 est complexe puisqu'au moins 2 sites distincts
d'interaction ont été identifiés jusqu'à présent: le site universel de reconnaissance
572RGD574 (Arg-Gly-Asp) et une séquence dodécapeptide 4ooHHLGGAKQAGDV411
(H12). Cependant, il n'est pas encore clairement défini si ces 2 sites de
reconnaissance fonctionnent indépendamment, de façon synergIque ou par
compétition.
Au cours de ce travail de thèse, nous avons examiné au niveau moléculaire le
rôle respectifdes motifs dodécapeptide et 572RGD574 du fibrinogène dans le processus
d'étalement cellulaire médié par l'intégrine CXllb~3, au niveau de plaquettes sanguines
humaines et de cellules CHO exprimant soit le recepteur recombinant sauvage
CXllb~3wt, soit le récepteur constitutivement actif CXllb~3T562N ou non-fonctionnel
CXllb~3D119Y, et en utilisant le fibrinogène entier ou des fragments protéolytiques de
fibrinogène, le fragment D ne contenant que la séquence dodécapeptide, et le
fragment C ne présentant que le motif572RGD574.
Nos résultats mettent pour la première fois en évidence 2 VOles de
signalisation indépendantes mais synergiques, la première voie initiée par le site
dodécapeptide du fibrinogène reconnu par la sous-unité Ullb, et conduisant à un
attachement cellulaire, à la formation de complexes focaux, à la phosphorylation de
FAK et à l'activation de Racl, et la seconde voie impliquant le motif572RGD574 qui
joue un rôle de commutateur moléculaire au niveau de la sous-unité ~3, entraînant
l'activation maximale de RhoA, la polymérisation et l'organisation de l'actine en
fibres de stress, la formation d'adhérences focales matures et l'étalement cellulaire
complet.
Mots clés: intégrine CXllb~3 - cellules CHO -plaquettes sanguines - fibrinogène
fragments de fibrinogène - RGD -dodécapeptide - fibres de stress -RhoA GTPases.
TABLE DES MATIERES
Tabledes matières 1
Tabledes illustrations 5
Abréviations 7
Liste des publications etcommunications 9
INTRODUCTION 13
Chapitre1: Lafamille des intégrines 15
1. Les récepteurs d'adhérence 15
2. Les intégrines 19
2.1. Diversitédes intégrines 21
2.2. Caractéristiquesdes sous-unités a 21
2.2.1. Généralitésetclassification 21
2.2.2. Lesdomaines fonctionnels 23
2.3. Caractéristiquesdes sous-unités ~ 24
2.3.1. Généralités etclassification 24
2.3.2. Les domainesfonctionnels 25
3. Mode de fonctionnement des intégrines 27
3.1. Signalisation «inside-out» etactivation des intégrines 31
3.2. Clusteringdes intégrines signalisation «outside-in » 32
ChapitreII: Relation structure-fonction de l'intégrine alIb~3 35
1. Rôle physiologiquede l'intégrine alIb~3à lasurface plaquettaire 35
2. Structurede !'intégrine alIb~3 37
2.1. Biosynthèseet formation du complexeallb~3 37
2.2. Les domainesextracellulaires 39
2.3. Les partiescytoplasmiqües .42
3. Spécificitéde reconnaissance .44
3.1. Généralités .45
3.2. Biosynthèseetstructure du fibrinogène .47
3.3. Les sites d'interaction du fibrinogène avec l'intégrine allb~3 .48
3.4. Rôle du fibrinogène dans le processus d'hémostase 55
4. Le mécanismed'activationde l'intégrine allb~3 57
4.1. Rôle des partiescytoplasmiques de l'intégrine allb~3 59
4.2. Rôle des domaines transmembranaires de l'intégrine allb~3 61
4.3. Rôle de latalinedans l'activation de l'intégrine allb~3 63
4.4. Les modificationsconformationnelles des domaines extracellulaires
de l'intégrine allb~3 65
4.5. Rôle des ponts disulfure intramoléculaires au niveau de ~3 68
1
ChapitreIII :Lasignalisation intracellulaire médiée paralIb~3 71
1. Lasignalisation inside-out 71
2. Lasignalisationoutside-inalIb~rdépendante 73
2.1. Recrutementetrôlesjouésparles protéinesdu cytosquelette 75
2.1.1. Rôle de lataline 75
2.1.2. Rôle de lavinculine 77
!
2.1.3. Rôledelapaxilline 77
2.1.4. Rôle de l'a-actinine 78
2.1.5. Autres protéines 78
2.2. Les protéinesde lasignalisation 79
2.2.1. Lafamille des Srckinases 79
2.2.2. Laprotéine Syk 83
2.2.3. LaFAK 85
2.2.4. Laprotéine Shc 86
2.2.5. LaPl3-kinase 86
2.2.6. Lafamille des RhoGTPases 86
2.2.7. Autres protéines 87
ChapitreIV : Lafamille des RhoGTPases 89
1. Étude physiologiquedes protéinesde lafamille desRhoGTPases 89
1.1. Description etstructuredes RhoGTPases 89
1.2. Modede fonctionnement des RhoGTPases 91
1.2.1. Généralités 91
1.2.2. Les RhoGTPases et leurs régulateurs 93
1.2.2.1. LesGEFs 93
1.2.2.2. Les GAPs 95
1.2.2.3. LesG.DIs 95
1.2.2.4. Étudede larégulationde l'activitéde RhoA 97
1.2.3. Les RhoGTPases etleurseffecteurs 99
1.2.3.1. Leseffecteursde Cdc42 etRac 99
1.2.3.2. Leseffecteursde RhoA 101
2. Rôles physiologiques des RhoGTPasesauniveauducytosquelette 103
OBJECTIFS•....•.••.•..•.•.•..•.••.•......•..•.•......•..••..•.•..•.•.•..•.•.•................•.•......•......•...•....•...............................107
RÉSULTATS.•..•.•..•.•..•.•....•....•.•..•.•....•.•..•.•...•..•.•..•.•.•..•.•....•.•.•....•.•.••...•..•.•.•.•..•.•.•.•....•.•.•..•...•.•........•.•..113
Chapitre 1: Un nouveau rôle fonctionnel du motif RGD du fibrinogène en tant que
commutateur moléculaire responsable de l'activation spécifique de RhoA au
cours duprocessusd'étalementcellulairemédié parl'intégrine alIb~3 115
INTRODUCTION 117
Article I. "A new functional role of the fibrinogen RGD motif as the
molecular switch that selectively triggers integrin alIb~rdependent RhoA
activation duringcell spreading" 123
Article II. Revue: "RGD,the Rho'd to cellspreading" 135
DISCUSSION 143
2
Chapitre II: Influence des conditions de flux au niveau de l'attachement et de l'étalement
cellulaire sur fibrinogène et facteur von Willebrand immobilisés, de cellules
CHO exprimant l'intégrine a"b~3à l'étatde repos ou constitutivementactivée 153
INTRODUCTION 155
Article lll. "CHO cells expressing the high affinity a"b~3T562N integrin
demonstrateenhanced adhesion undershear" 157
DISCUSSION 169
CONCLUSION ET DISCUSSION FINALE 173
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPIDQUES 189
ANNEXE: Matériel et Méthodes 215
.S.~
..D. : U.H.P. NANCY 1
, "'}':: rr-.... S--:/f:NCES
Rl.J~
I:::A~ l ' , . 'Ljua - BP 11
.."",01 VILLERS-LES-NANCY Cedex
3

TABLE DES ILLUSTRATIONS
FIGURES:
Figure 1: La super-familledes récepteurs d'adhérence 16
P
Figure2: Organisation structuraledessous-unités (X et des intégrines 22
Figure 3: Les diverses fonctions cellulairescontrôléespar les intégrines 28
Figure4: Mécanisme bidirectionnel designalisation médié par les intégrines 30
Figure 5: Structure de l'intégrine (XIIbP3 .40
Figure 6: Schématisation au niveau atomique des sites MIDAS, L1MBS et AOMIDAS
de lasous-unité P3 .40
Figure 7: Structure de la molécule de fibrinogène .46
Figure 8: Visualisation spatiale de l'interaction d'un peptide synthétique RGO avec (XvP3 50
Figure 9: Représentation des domaines Cap etSOL de l'intégrine UIIbP3 52
Figure 10 :Modèle d'activation de l'intégrine 56
Figure 11 :Représentation des parties cytoplasmiques de l'intégrine(XIIbP3 58
Figure 12 :Représentation des domaines transmembranaires de l'intégrine (XIIbP3 60
Figure 13 :Séparation spatiale des parties cytoplasmaiquesettransmembranaires de l'intégrine
lorsde l'activation 62
Figure 14 :Représentation des partiesextracellulaires de l'intégrine (XIIbP3 66
Figure 15 :Arrangementsdes protéinesdu cytosqueletteau niveaudes adhérences focales 76
Figure 16: Régulation de l'activité de Srcau cours de l'activation de l'intégrine (XIIbP3 80
Figure 17 : Implication de la protéine Sykdans la signalisationoutside-in 82
Figure 18 :Rôle de pivotde laFAK dans lasignalisation outside-in 84
Figure 19 :Cycle de régulationde l'activité des protéines de lafamille des RhoGTPases 90
Figure20: Mécanismede régulation de l'activité de Rho 96
Figure21 :Rôle des RhoGTPases dans la formation des complexes focaux etdes adhérences
focales 102
Figure22 : Interactionde l'intégrine UIIbP3 avec la séquence dodécapeptidedu fibrinogène 119
Figure23 :Modèled'adhésion cellulairesur fibrinogène immobilisé médié parUIIbP3 151
Figure24 :Réarrangements conformationnelsdes partiesextracellulairesde l'intégrine (XIIbP3 176
Figure25 :Modélisation du mécanismed'activation des intégrines médié par la taline 180
Figure26 :Représentation structuraledes intégrinesusP1et(XvP3 en complexe avec la fibronectine 183
Figure27 :Représentation en ruban des modules 111-9et11I-10de lafibronectine 185
Figure28 :Complexitédes voiesdesignalisation intracellulaires 187
5