alexandre dermargos

156 Pages·2007·3.73 MB·Portuguese

ALEXANDRE DERMARGOS

FGF-2: estudo de estrutura e função

Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)

Orientador: Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin

São Paulo
2007
ii
Alexandre Dermargos
FGF-2: estudo de estrutura e função

Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)

Aprovado em: ____________

Banca Examinadora

Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________

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Aos meus pais, que mesmo sem saber nada sobre
ciência, me ensinaram as coisas mais essenciais da
vida, que me permitiram trilhar este caminho.
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Agradecimentos

Apesar de vivermos com o relógio em nossos pulsos, muitas vezes não nos damos
conta que tudo tem uma hora para começar e tudo tem uma hora para terminar.
Parece estranho, mas num país que ama chuteiras, as pessoas às vezes não
percebem que a vida é parecida com uma partida de futebol, tem momentos
eletrizantes, outros sem graça, alguns mais alegres, outros tristes. A principal
diferença entre a vida e o futebol, é que a partida de futebol dura 90 minutos e o
juiz soa o apito final. A vida não sabemos o quanto durará. Bom, chegou a hora de
terminar um ciclo na minha vida, o doutorado, afinal o juiz já estava olhando para o
relógio. Apresento a vocês, a minha tese (o tão famoso livro que sempre falava a
minha família que estava escrevendo), que acabou de nascer. Venho a agradecer
algumas pessoas que tornaram este parto possível...

Ao Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin, meu chefe e orientador. Obrigado, por ter
orientado (tirado e colocando pedras no meu caminho), pela liberdade, paciência e
pela amizade. Levarei comigo um pouco de sua extensa sabedoria e sei que um dia
sentirei falta dos momentos de “Forrest Gump – O Contador de Historias”, onde tive
a oportunidade única de ouvir direto de um personagem real, histórias de como a
bioquímica se formou.

Aos colegas do Laboratório de Pesquisa de Fatores de Crescimento, Ciclo Celular e
Hormônios, atuais (Carlinha, D. Cleusa, Jac, Ju, Mari, Nakano, Tati) pelas conversas
úteis e fúteis tornado o ambiente do nosso laboratório agradável, pela pipoca,
bolachas e café. Aos ex-membros (Ana, Cau, Carol, Celina, Érico, Kátia, Ivan, D.
Maria, Miriam, Paula, Rose, Telma, entre outros) pelo convívio de anos a fio.

Não poderia esquecer: Eva, que sempre a encontrava sorrindo no laboratório aos
sábados; Forti, meu afilhado turrão, um verdadeiro “Rui Chapéu” do bilhar, obrigado
pelos conselhos acadêmicos e pessoais; Gilson, com que divido não só a bancada e
bagunça, mas também idéias e projetos, obrigado pelo aprendizado e amizade; e ao
Matheus Henrique, camisa 9 (grande artilheiro do seu time), exímio fazedor de meio
e professor da “arte”, obrigado por ser um bom garoto!

Aos vizinhos e amigos de bloco: Camila, César, Margot, Susan e todos os demais do
Laboratório da Profa. Dra. Bianca Zingales; Edlaine e demais do Laboratório da Profa.
Dra. Ohara Augusto; todos sempre solícitos e amigáveis. Ao meu “amigo-irmão”
Aurélio, que muitas vezes me ensinou bioquímica e lições de vida. Ao Marcelão, Sô e
Shadow vizinhos que se tornaram amigos.

As bancas de qualificação e de defesa da tese, por aceitarem e colaborarem com o
enriquecimento do trabalho e pessoal, fortalecendo a minha formação cientifica.

Ao Instituto de Química da USP, em seus professores e funcionários; a todo o corpo
docente do Departamento de Bioquímica, pela formação que vem desde a graduação
pela dedicação não só acadêmica, mas também pessoal.
v

Ao LNLS (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, Campinas – SP) aonde foram
realizados os experimentos de modelagem molecular e duplo hibrido de levedura. Ao
Dr. Sergio Oyama, pelas conversas sobre a vida e ciência, por ter me guiado nos
caminhos da bioquímica “virtual” e pela amizade. Ao Prof. Dr. Nilson I. T. Zanchin e a
Tereza Lima, pela sua dedicação, por um treinamento em bioquímica “úmida” de
bancada e pela colaboração.

Ao Prof. Dr. Rui Curi e membros do seu laboratório, pelo auxilio nos experimentos de
morte celular envolvendo o FACS e pelo convívio.

A Profa. Dra. Ana Campa pela colaboração nos trabalhos não apresentados nesta
tese, mas que acredito que em breve serão publicados.

Não poderia esquecer o seio familiar. Aos meus pais Markoss (in memorian) e Cecy,
pelo amor, carinho, puxões de orelhas, conselhos e pedidos da calma. Apesar de
serem simples e não saberem nada de ciência, sempre me incentivaram a estudar e
me apoiaram em tudo. Minha “irmã” Idi, conselheira, apaziguadora e minha fã
incondicional. Meus primos-irmãos que estão distantes, mas sempre preocupados e
carinhosos. A minha madrinha Victoria, pelo amor, carinho e histórias do meu
passado sírio.

Elaine, este livro começou a nascer quando nos “conhecemos” e agora ele está
nascendo. Sei da sua contribuição nele. Sei também o quanto sou feliz por encontrar
em você, o conselho e o julgamento, a alegria de viver e uma coragem inexplicavel,
isto sem falar que você é também o amor da minha vida.

E a todos os meus “não citados” amigos, agora posso dizer que terminei de escrever
o meu livro.

Este projeto teve o suporte financeiro da FAPESP e CNPq.
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”You may be right and I may be wrong, and with a
litttle effort we may get nearer to the truth”

“Voçê pode estar certo e eu posso estar errado, e
com um pequeno esforço nós podemos juntos
chegar mais próximos da verdade”.

Karl Popper
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Resumo

Dermargos, A. FGF-2: estudo de estrutura e função. 156p. Tese - Programa de Pós-
Graduação em Ciências (Bioquímica). Instituto de Química, Universidade de São
Paulo, São Paulo.

FGFs compreendem um grande família de 24 proteínas, participando de processos
chaves nos mais variados tecidos, tendo funções parácrina, autócrina e intrácrina,
regulando mitogênese, diferenciação celular, morfogênese e cicatrização. Mas, a
relação estrutura-função dos FGFs é pobremente entendida. O membro protótipo
desta família é o FGF-2, que apresenta quatro isoformas moleculares incluindo a
forma de 18 kDa que é secretada e se liga aos receptores específicos (FGFRs) e
dispara uma complexa sinalização. As outras isoformas, de alto peso molecular (21,
22 e 22,5 kDa) são expressas por códons alternativos (CUG) e permanecem no
interior da célula interagindo com parceiros moleculares desconhecidos. Para
antecipar mecanismos e parceiros do FGF-2 HMW foi realizada modelagem molecular
desta isoforma que mostrou: uma estrutura do N-terminal da proteína com motivo
β→α→β e manutenção do barril β. A busca por parceiros intracelulares, foi realizada
através da técnica do duplo hibrido de levedura, usando um biblioteca de cDNA de
cérebro de rato. Foram encontrados 4 possíveis parceiros: BRD2, UBE2I, BRPF1,
PC4. Todas essas interações foram confirmadas através do crescimento da levedura
em meio sem histidina, produção de β-galactosidase e ensaios de “pull-down” com
GST. Analises por FACS confirmam que FGF2 não causa apoptose em células
adrenais tumorais Y1 de camundongo, mas promovem um acumulo de células na
fase S com bloqueio do ciclo celular e da proliferação, configurando uma forma de
senescência. Resultados com as células humanas HEK-ER:Ras permitem fazer a
seguinte generalização: FGF2 induz senescência em células malignas transformadas
pelos oncogenes ras. A superexpressão da proteína de fusão FGF-2(18kDa):protA,
mas não a da FGF-2(22,5 kDa):protA, protege a célula Y1 da senescência induzida
por FGF-2. Por outro lado, a superexpressão destas mesmas isoformas de FGF-2
fusionadas à proteína A em células imortalizadas Balb3T3 não causou transformação
celular e nem alterou a resposta mitogênica destas células ao FGF-2 recombinante
adicionado ao meio de cultura. Células Y1 quando tratadas com FGF-2 recombinante
produz ROS intracelular e libera anions superóxido no meio extracelular. Além disso,
o anti-oxidante NAC protege estas células da indução de senescência induzida por
FGF-2, sugerindo que ROS pode ser intermediário no disparo de senescência por
FGF-2.

Palavras-chave: FGF, FGF-2, estrutura e função de proteínas, proliferação celular,
senescência, morte celular.
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Abstract

Dermargos, A. FGF-2: Study of structure and function. 2007. 156p. PhD Thesis -
Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo,
São Paulo.

FGFs comprise a large family of 24 proteins that play key roles in a number of tissues
as local paracrine, autocrine and intracrine regulators of mitogenesis, cellular
differentiation, organ morphogenesis and tissue repair. Structure-function
relationship among FGFs is still poorly understood. FGF-2, the family prototype
member, exists as four molecular species. The 18 kDa form is released to the extra-
cellular milieu and binds to specific receptors (FGFR), initiating a complex array of
signals. Other isoforms of higher molecular weights (21, 22 and 22,5 kDa) are
translated from alternative codons (CUG) and remain inside of the cell interacting
with unknown partners. Aiming to anticipate mechanisms and partners, we modeled
the FGF2-HMW molecule, showing that the protein displays a β→α→β motif in the N-
terminal region and maintains the β-barrel structure common to all FGFs. By the
yeast two-hybrid method, using a cDNA rat brain library, we found four possible
partners for FGF2-HMW: BRD2, UBE2I, BRP1 and PC4. All partners were confirmed
by yeast growth without histidine, production of β-galactosidase and “pull-down”
assays with GST. FACS analyses confirmed that FGF2 does not cause apoptosis in
mouse Y1 adrenal tumor cells. But, FGF2 inhibited S phase progression blocking cell
cycle and proliferation, characterizing a form of senescence. In addition, results
obtained with the human HEK-ER:Ras cells support the following general statement:
FGF2 triggers senescence in malignant cells transformed by ras oncogenes. Ectopic
expression of the fusion protein FGF-2(18 kDa):protA, but not of FGF-2(22,5
kDa):protA, protected Y1 cells senescence induced by FGF-2. On the other hand,
ectopic expression of FGF-2 isoforms fusioned to protA in Balb3T3 immortalized cells
did not cause transformation and neither modified the mitogenic response of this cell
to recombinant FGF2. Recombinant FGF-2 stimules Y1 cells to produce intracellular
ROS and to release superoxide anions into intracellular medium. Moreover, the ROS
scavenger NAC protect Y1 cells from senescence induced by FGF-2, suggesting that
ROS may be mediate senescence triggering induced by FGF-2.

Keywords: FGF, FGF-2, protein structure and function, cell proliferation, senescence,
cell death.
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Lista de Abreviaturas e Siglas

BrdU bromodeoxiuridina
4-OHT 4-hidroxitamoxifen
ACTH Hormônio Adrenocorticotrópico ou Adrenocorticotropina
AKT ou PKB Proteína kinase B
DMEM “Dulbeco modified Eagle medium”
DTT ditiotreitol
ERK Extracellular signal regulated kinase
ERK “Extracellular signal regulated kinase”
FACS Análise de citometria de fluxo, FACS, do inglês:
FCS Soro fetal bovino
FCS Soro fetal bovino, do inglês: Fetal calfum serum
FGF Fator de crescimento de fibroblasto
FGFR Receptores específicos para FGF
GDP Guanosina difosfato
GTP Guanosina trifosfato
HSGAG Heparan-sulfato glicoaminoglicano
IPTG “Isopropilthiogalactoside”
MAPK “Mitogen-Activated Protein Kinase”
NAC N-acetil-L-cisteína
ORF Abertura de fases de leitura, do inglês “Open reading frame”
p53 Proteína repressora p53
PBS Solução salina tamponada
PBSA +2 +2
Solução salina tamponada sem Ca sem Mg
pERK ERK fosforilada (ativa)
PI Iodeto de propídio; PI, do inglês: “propidium iodide”
PI3K Fosfatidilinositol-3 Kinase
PKA Proteína quinase A
PKC Proteína quinase C
PLC “Fosfolipase-C”
PMA Phorbol 12-myristate-13-acetate
PMSF Fenilmetano Sulfonil Fluoreto
Ras “Rat Sarcoma Virus”
RMN Ressonância Magnética Nuclear
ROS Espécies reativas de oxigênio; ROS, do inglês: reactive oxygen
species.
SDS Dodecil sulfato de sódio
TCA Ácido tricloro acético
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Índice

1. INTRODUÇÃO...............................................................................................16
1.1. A família dos Fatores de Crescimento de Fibroblastos (FGFs) ......................17
1.2. O FGF-2 .................................................................................................23
1.3. Os FGFRs (Fibroblast growth factor receptors)...........................................27
1.4. Proteínas: domínios funcionais e complexos protéicos ................................30
1.4.1. Duplo-híbrido de levedura..................................................................31
1.4.2. Modelagem Molecular........................................................................35
1.4.3. Proteínas de fusão.............................................................................37
1.5. Ciclo celular: proliferação, senescência e morte. O papel do FGF-2 e de ROS41
1.6. A Linhagem Celular Y1.............................................................................46
2. OBJETIVOS...................................................................................................48
2.1. Objetivo geral.........................................................................................49
2.2. Objetivos específicos desta tese...............................................................49
3. MATERIAIS E METODOS................................................................................51
3. MATERIAIS................................................................................................52
3.1. Linhagens celulares..............................................................................52
3.2. Linhagem de levedura..........................................................................52
3.3. Plasmídeos..........................................................................................53
3.4. Fator de crescimento de fibroblasto.......................................................53
3.5. Inibidores de Fosfatase ou Protease ......................................................54
3.6. Kits.....................................................................................................54
3.7. Drogas e Antibióticos............................................................................55
3.8. Soro e meio de cultura.........................................................................55
3.9. Isótopo radioativo................................................................................56
3.10. Enzimas.............................................................................................56
3.11. Anticorpos.........................................................................................56
3.12. Oligonucleotídeos:..............................................................................57
3.13. Soluções............................................................................................58
3.14. Reagentes.........................................................................................59
3.15. Equipamentos....................................................................................59
3.2. MÉTODOS ..............................................................................................61
3.2.1. Cultura de células..............................................................................61
3.2.2. Carenciamento celular.......................................................................61
3.2.3. Transfecção de células.......................................................................62
3.2.4. Extração de RNA...............................................................................63
3.2.5. Reações de RT-PCR...........................................................................64
3.2.6. Extração dos produtos do PCR............................................................64
3.2.7. PCR em Tempo Real (PCR quantitativo ou Real-time PCR).....................65