Alex EYRAUD

168 Pages·2014·8.65 MB·French

ANNÉE 2014
THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1
sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne
pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1
Mention : (Biologie)
Ecole doctorale (Vie Agro Santé)
présentée par
Alex EYRAUD
Préparée à l’unité de recherche INSERM U835
Laboratoire de biochimie pharmaceutique
Faculté de pharmacie
Etude fonctionnelle et Thèse soutenue à Rennes
le 03 juillet 2014
structurale d’un ARN
devant le jury composé de :
régulateur exprimé Pr. Patrick LINDER
Professeur CMU / rapporteur
Dr. Adriana RENZONI
par les
Biologiste/Chercheur HUG / rapporteur
Dr. Philippe BOULOC
staphylocoques
Directeur de recherche IGM / examinateur
Pr. Reynald GILLET
dorés : Implication
Professeur IGDR / examinateur
Pr. Brice FELDEN
dans la résistance Professeur Inserm U835 / examinateur
Dr. Svetlana CHABELSKAYA
aux antibiotiques Ingénieure de recherche Inserm U835 /
co-directeur de thèse
Remerciements
A l’écriture de ces lignes, je suis convaincu que la thèse est loin d’être un travail solitaire. Je n’aurais
jamais pu réaliser ce travail sans le soutien d’un grand nombre de personnes dont la gentillesse, les
échanges et les conseils m’ont permis d’apprendre et de progresser.
Je tiens tout d’abord à remercier les membres de mon jury, Patrick Linder, Adriana Renzoni, Philippe
Bouloc et Reynald Gillet, d’avoir accepté d’évaluer ce travail.
Je souhaite exprimer ma gratitude à Brice Felden pour m’avoir accueilli au sein de son équipe. Je
remercie également Pierre Tattevin pour m’avoir permis de réaliser ce doctorat.
Je tiens à adresser mes plus chaleureux remerciements à Svetlana qui m’a permis de réaliser cette
thèse dans les meilleures conditions. Merci de m’avoir aidé à façonner mon esprit scientifique, pour
tes enseignements et pour tes qualités humaines  Ta présence, nos discussions et nos rires ont été
important tout au long de ma thèse.
Je souhaite ensuite remercier Valérie, pour ses conseils avisés et ses aptitudes au dessin (qui ont
égayées mes journées). Merci également à Nathalie pour m’avoir donné le sourire chaque matin dès
mon arrivée au labo. Merci à toutes les trois pour nos délires et nos blagues qui ne sont accessibles
qu’aux initiés.
Je remercie les copains de galères (les autres doctorants que j’ai croisés aux laboratoires) : Nour,
Julien, Régine, Lorraine et Tony. Je voudrais remercier les membres passés et présents de l’équipe :
Hélène, Noëlla, Marie-Laure, Astrid, Yoann, Nadège, Annick, Olivia, Amor, Emilie, Félix, Isabelle,
Marguerite et tout particulièrement Marc, pour ses conseils compliqués mais précieux.
Je remercie tous les chercheurs qui ont suivi ce travail, merci pour vos conseils et vos encouragements.
Merci à Serge Hardy, Carlos Blanco, Philippe Bouloc, Pierre-Yves Donnio, Eric Massé, David
Lalaouna, Agnès Méreau, Philippe Chafey, etc.
Un grand merci à Tièkoura qui a été le premier à me donner envie de travailler dans la recherche.
Merci à mes amis Thierry, Marie, Loïc, Stéphanie, Samuel (pour les agréables moments passés en
votre compagnie qui permettent d’aller de l’avant), Vincent, JB, Ludo, Yves, Manu, Leslie, Nico,
Yann et aux multiples Sophie.
Je ne pourrais pas conclure sans remercier ma famille qui a su m’apprendre que tout est possible à
celui qui s’en donne les moyens. Merci de m’avoir enseigné la valeur de la vie et de m’avoir offert la
possibilité de réussir dans ce qui me passionne.
Je souhaite également également remercier ma belle famille pour leur soutien et leur gentillesse.
Enfin, un grand merci à Marion qui colore chaque jour de ma vie. Merci pour ton soutien et ton aide
dans les moments difficiles, pour nos joies et nos rires. Merci d’être là.
J’en oublie certainement encore et je m’en excuse. Encore un grand merci à tous.
Table des matières
Introduction ............................................................................................................................................. 1
1. Les ARN régulateurs ................................................................................................................... 2
1.1. Historique ................................................................................................................................ 2
1.2. Les ARN régulateurs bactériens .............................................................................................. 2
1.2.1. Les Riboswitchs .......................................................................................................... 3
1.2.2. Les ARNrég interagissant avec des protéines ............................................................. 6
1.2.3. Les ARNrég interagissant avec des acides nucléiques ................................................ 7
2. Staphylococcus aureus .............................................................................................................. 19
2.1. Découverte et caractéristiques générales ............................................................................... 19
2.2. Le génome du staphylocoque doré ........................................................................................ 20
2.3. Virulence du Staphylococcus aureus ..................................................................................... 22
2.3.1. Une bactérie commensale .......................................................................................... 22
2.3.2. Un pathogène opportuniste ........................................................................................ 23
2.3.3. Les facteurs de virulence du staphylocoque doré ...................................................... 24
2.3.4. Régulations et contrôles de la pathogénie ................................................................. 28
2.4. Les nombreuses résistances aux antibiotiques de S. aureus .................................................. 35
2.4.1. Les antibiotiques ........................................................................................................ 35
2.4.2. Mécanismes d’actions des antibiotiques.................................................................... 35
2.4.3. Résistances du staphylocoque doré à de nombreux antibiotiques ............................. 36
3. Contexte d’étude et objectifs de la thèse ................................................................................... 39
Résultats ................................................................................................................................................ 41
1. Caractérisation de SprX ............................................................................................................. 42
1.1. Environnement génétique de sprX dans N315 et HG001 ...................................................... 42
1.2. Conservation des séquences de sprXN, sprX1 et sprX2 ........................................................ 43
2. Etude de l’expression de SprX .................................................................................................. 44
2.1. Profil d’expression de SprX pendant la croissance bactérienne ............................................ 44
2.2. Etude de l’effet de conditions de stress sur l’expression de SprX ......................................... 45
3. Recherche de cibles de SprX ..................................................................................................... 47
3.1. Article .................................................................................................................................... 47
3.2. Effet de SprX sur l’expression de SpoVG dans la souche N315 ........................................... 76
3.3. Différence dans la régulation de l’expression de SpoVG entre SprX1 et SprX2 .................. 77
3.3.1. Comparaison de l’inhibition de l’expression de la protéine SpoVG induite par SprX1
ou SprX2 in vivo ........................................................................................................................ 77
3.3.2. Complémentations plasmidiques de l’expression des ARN SprX1 et SprX2 ........... 78
3.3.3. Comparaison de l’effet de SprX1 et SprX2 sur SpoVG in vitro ............................... 80
Discussions et perspectives ................................................................................................................... 82
Matériels et méthodes ............................................................................................................................ 94
Références bibliographiques ............................................................................................................... 102
Annexes ............................................................................................................................................... 124
Liste des abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique PSM : Phenol soluble modulin
agr : Accessory gene regulator PVL : Leucocidine de Panton-Valentine
AIP : auto-inducing peptide RACE : Rapid amplification of cDNA ends
Amp : Ampicilline RBS : Ribosome binding site
ARN : Acide ribonucléique RNase : Ribonucléase
ARNm : ARN messager Rsa : RNA Staphylococcus aureus
ARNp : ARN polymerase Rsao : RNA S. aureus Orsay
ARNr : ARN ribosomal Sae : staphylococcal accessory element locus
ARNrég : ARN régulateur Sak : Staphylokinase
ARNt : ARN de transfert SAM : S-adenyl méthionine
ARNtm : ARN transfert-message SaPI : Ilôts de pathogénie
BHI : Brain heart infusion Sar : Staphylococcal accessory regulator
CHIPS : Chemotaxis inhibitory protein SARIV : S. aureus résistant intermédiaire à la
Clf : Clumping factor vancomycine
CRISPR : Clustered Regularly Interspaced SARM : S.s aureus résistant à la méthicilline
Short Palyndromic Repeats SARV : S. aureus résistant à la vancomycine
Eap : extracellular adherence protein S. aureus : Staphylococcus aureus
E. coli : Escherichia coli SCC : Staphyloccocal chromosome cassette
Efb : Extracellular fibrinogen-binding protein SD : Shine-Dalgarno
Emp : Extra-cellular matrix protein SERAM : secretable expanded repertoire
Erm : Erythromycine adhesive molecules
Fnbp : Fibronectin binding protein Spr : Small pathogenicity island RNA
GlcN6P : Glucosamine-6-phosphate SSR : Small stable RNA
LB : Luria Broth TA : Système toxine-antitoxine
L. monocytogenes : Listeria monocytogenes TAP : Tobacco acid phosphatase
MGE : Mobile genetic elements TCS : Système à deux composants
MSCRAMM : microbial surface component TSB : Tryptic soy broth
recognizing adhesive matrix molecules TSST-1 : Toxic shoc syndrom toxin 1
NTP : Nucléoside triphosphate UA : Unité arbitraire
NZM : NZ amine medium USA : United-States of America
Orn : Oligoribonucléase VIH : Virus de l’immuno-déficience humaine
Pbp : penicillin-binding protein
PCRq : Quantitative polymerase chain reaction
Introduction
Introduction
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Introduction
1. Les ARN régulateurs
1.1. Historique
Les acides ribonucléiques (ARN) ont été identifiés vers la fin du 19ème siècle. Ce sont des
polymères linéaires constitués d'un enchainement de nucléotides. Chaque nucléotide contient
un sucre appelé ribose, une base azotée et un groupement phosphate impliqué dans les liaisons
phosphodiester qui relient chaque nucléotide. Il existe quatre bases azotées : l’adénine, la
cytosine, la guanine et l’uracile (qui remplace la thymine contenue dans les acides
désoxyribonucléiques, ADN). L’information génétique, contenue au sein de l’ADN, est
transcrite en ARN messager (ARNm) qui est traduit en protéine. Il a été considéré pendant un
temps que le transcriptome était purement un système intermédiaire, avec le concept basique
suivant : un gène, un ARNm, une protéine. La découverte de plusieurs types d’ARN transcrits
qui ne codent pas des protéines indiqua un rôle plus important des ARN que celui
précédemment imaginé (revue Gustincich et al., 2006). En effet, après la découverte des ARN
de transfert (ARNt) et ribosomaux (ARNr), impliqués dans le processus de traduction, des
ARN catalytiques ont été identifiés. Il s’agit d’ARN dont la particularité est d’agir comme
catalyseur de la même manière que le font les protéines enzymatiques. La ribonucléase P
(RNase P), découverte en 1971, fut le premier ARN catalytique découvert (Altman and Smith,
1971). La RNase P est une ribonucléoprotéine constituée d’un ARN catalytique et de
protéines. La fonction ribozyme de la RNase P mature l’extrémité 5’ des ARNt précurseurs en
ARNt. Cette enzyme, impliquée dans les fonctions essentielles des organismes vivants, fait
partie des gènes de ménage. Elle est présente dans toutes les cellules vivantes. Depuis de
nombreux types d’ARN non codant ont été identifiés. Je vais ici m’intéresser plus
particulièrement à la classe des ARN régulateurs (ARNrég) chez les procaryotes.
1.2. Les ARN régulateurs bactériens
Les ARN régulateurs sont un groupe de molécules qui peuvent agir par de multiples
mécanismes pour moduler une grande variété de réponses physiologiques. Chez les
procaryotes, l’ARN 6S fut parmi les premiers ARN régulateurs identifiés en 1967 (Hindley,
1967). Cependant, bien qu’il fût rapidement séquencé (Brownlee, 1971), une trentaine
d’années auront été nécessaires à l’identification de sa fonction. L’ARN 6S est responsable de
la séquestration de la sous-unité sigma70 de l’ARN polymérase (Wassarman and Storz,
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Introduction
2000). En 1981, un autre ARNrég a été identifié et sa fonction déterminée. Il s’agit de l’ARN
I qui régule la réplication du plasmide ColE1 d’Escherichia coli (Stougaard et al., 1981;
Tomizawa et al., 1981). Peu de temps après, les fonctions d’autres ARN régulateurs ont été
identifiées, dont l’ARN MicF (Mizuno et al., 1984). Jusqu’au début des années 2000, peu
d’ARN régulateurs avaient été identifiés en partie due aux techniques disponibles qui ne
permettaient l’identification que d’ARN abondamment exprimés et de grande taille (revue
Wassarman et al., 1999). Depuis, les prédictions bio-informatiques ainsi que l’explosion des
techniques à haut débit ont permis l’identification de très nombreux ARN (Altuvia, 2004;
Kawano et al., 2005 ; Huttenhofer and Vogel, 2006 ; Kazantsev and Pace, 2006; Moore and
Sauer, 2007; Holbrook, 2008). D’une taille comprise entre 50 et 500 nts, les ARNrég sont des
molécules stables qui permettent aux bactéries de répondre rapidement à des changements de
conditions environnementales (Masse et al., 2003; Gottesman, 2005; Vogel, 2009). Bien
qu’identifiés initialement en tant qu’ARN non codants, il s’avère que cette appellation est
fausse car plusieurs ARNrég possèdent une phase codante en plus de leur fonction de
régulateur. Mis à part les riboswitchs, les régulations par les ARNrég sont réalisées soit par
des interactions avec des protéines, soit avec des acides nucléiques, ADN et ARN. Les
ARNrég dont la fonction est connue sont organisés en plusieurs classes en fonction de leur
mécanisme d’action (revue Waters and Storz, 2009). Les ARNrég régulent la réplication et
l’expression des gènes à différents niveaux : la transcription de l’ADN, la stabilité de l’ARNm
et la traduction. Des particularités à chaque mécanisme sont régulièrement découvertes, je
vais ici vous décrire les plus répandus.
1.2.1. Les Riboswitchs
L’extrémité 5’ non traduite des ARNm contient les séquences reconnues par le ribosome et de
ce fait, détermine le niveau de leur traduction. Par conséquent, toute modification de cette
région influence la traduction et/ou la transcription du gène en aval. Les riboswitchs sont des
domaines d’ARNm structurés situés dans ces régions non traduites qui peuvent lier
sélectivement des ligands et qui contrôlent l’expression des gènes (Breaker, 2012). Ils sont
appelés cis-acting RNA du fait qu’ils sont situés en 5’ ou 3’ du gène qu’ils régulent. Le terme
riboswitch définit les ARN qui contrôlent l'expression des gènes par liaison à des métabolites
sans la nécessité de facteurs protéiques. Cependant, bien que le terme riboswitch correspond
initialement aux ARN fixant des métabolites, il inclut également les ARN contenant des
domaines répondant à des changements de température (Johansson, 2009; Klinkert and
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Introduction
Figure 1. Principaux mécanismes d’action des riboswitchs.
Les riboswitchs bactériens répriment ou activent la transcription/traduction de gènes en
fonction de la configuration de la séquence leader de l’ARN. En réponse aux changements de
concentration d’un métabolite lié fonctionnellement au gène en aval, les riboswitchs
contrôlent la terminaison de la transcription (a,b), l’initiation de la traduction (c,d) ou les deux
à la fois si la structure de la tige-boucle qui permet la terminaison de la transcription séquestre
également le site d’initiation de la traduction. Dans chaque cas la fixation du métabolite (m)
spécifique sur son domaine senseur stabilise la structure du riboswitch prévenant la formation
de structure alternative de l’ARN qui pourrait être un terminateur (a) un anti-terminateur (b),
un séquestreur (c) ou un anti-séquestreur (d),. Le ribosome est représenté en bleu pale. Les
régions complémentaires de l’ARN sont indiquées en vert et en bleu. (Adapté de Nudler and
Mironov, 2004).
Introduction
Narberhaus, 2009), à la fixation d’ARNt (Gutierrez-Preciado et al., 2009), à la fixation d’ions
métalliques (Cromie et al., 2006; Dann et al., 2007), ou à des fonctions de type ribozymes.
Les riboswitchs sont communément composés de deux parties, la région dite aptamère, qui
fixe le ligand, et la plateforme d’expression, qui régule l’expression du gène via un
changement conformationnel de l’ARNm (Figure 1). La plupart des riboswitchs régulent
négativement l’expression des gènes lors de la fixation du ligand, cependant, un petit nombre
d’entre eux activent l’expression du gène suite à la fixation d’un ligand. Certains ARNm
peuvent contenir plusieurs riboswitchs qui répondent à des métabolites/stimuli différents. Les
différents types de riboswitchs peuvent être organisés en fonction de la nature de leur ligand
mais je vais ici décrire les différents types de mécanismes d’action des riboswitchs.
Généralement, la fixation du ligand sur le riboswitch provoque un changement de la structure
secondaire de l’ARNm qui peut aussi bien moduler la transcription de l’ARNm que sa
traduction.
- Les riboswitchs régulant la transcription
Chez les bactéries, la transcription et la traduction se déroulent dans le cytoplasme, il n’existe
pas de compartimentation comme chez les eucaryotes. Les ribosomes peuvent donc se fixer et
lire un ARN dont la transcription n’est pas terminée. Cette particularité permet aux
riboswitchs, la régulation de la transcription modification de la structure de leur ARNm en
cours de synthèse (Figure 1A et B). En effet, la fixation d’un ligand sur l’ARNm peut
modifier la structure 5’ non traduite de l’ARNm et conduit à la formation d’une tige stable
suivie de résidus riches en uraciles formant un terminateur de transcription intrinsèque (Figure
1B). Certains riboswitchs impliqués dans la terminaison de la transcription du gène n’ont pas
de terminateur de transcription intrinsèque (Bastet et al., 2011). C’est le cas du riboswitch de
mgtA chez Salmonella enterica. Ce riboswitch régule l’élongation de la transcription au
niveau de la région codante de mgtA en adoptant deux conformations mutuellement
exclusives en fonction des niveaux de Mg2+ cytoplasmique (Figure 2, Cromie et al., 2006).
Lorsque la bactérie se retrouve dans un environnement pauvre en Mg2+, la protéine kinase
PhoQ senseur du Mg2+ extracellulaire, phosphoryle la protéine de fixation à l’ADN PhoP. La
protéine PhoP phosphorylée interagit alors avec le promoteur de mgtA et initie sa transcription
(Figure 2). La protéine MgtA permet l’internalisation de Mg2+. Lorsque la concentration
cytoplasmique de Mg2+ atteint un certain seuil, le Mg2+ se fixe à la région 5’ non traduite de
l’ARNm mgtA et modifie sa structure secondaire. L’apparition d’une tige-boucle
supplémentaire dans la région 5’ non traduite stoppe précocement la transcription et abolit
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Introduction
Figure 2. Modèle de la régulation de l’expression de MgtA chez Salmonella.
Quand la bactérie est dans un environnement qui contient peu de Mg2+, le senseur PhoQ
répond au Mg2+ extra-cellulaire en phosphorylant le facteur de transcription PhoP qui va se
fixer au promoteur de mgtA et initier la transcription. Si le niveau de Mg2+ cytoplasmique
dépasse un certain seuil, le Mg2+ va se fixer sur la région 5’ non traduite de mgtA ce qui va
conduire à la formation d’une tige-boucle ARN qui va arrêter la transcription au sein de la
région 5’ non traduite. Lorsque la concentration en Mg2+ repasse en dessous d’un seuil, une
autre structure se forme, qui permet alors la transcription de l’ARN mgtA complet et la
traduction de la protéine MgtA. La production de MgtA permet l’internalisation de Mg2+ dont
la concentration cytoplasmique augmente. Lorsque celle-ci atteint un seuil, le Mg2+ se fixe au
niveau de la region 5’ non traduite de mgtA empêchant ainsi l’expression de la proteine MgtA.
(Adapté de Cromie et al., 2006).