acta-entomologica-sinica-4369

2008·0.68 MB·

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&&’，(（) *）：*&)+*&’ ,--.&/(/0*%1*
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嗜线虫致病杆菌血腔毒素 对大蜡螟幼虫
!"#$
体内酶活性和中肠组织的影响
杨 君，王勤英!，宋 萍，南宫自艳，崔 龙
（河北农业大学植物保护学院，河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北保定 &H)&&)）
摘要：嗜线虫致病杆菌 -.&’/0$1234&.($#’50+)$在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆
虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理，明确关键的致病因子，作者应
用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法，从嗜线虫致病杆菌OP2)&菌株的细胞内分离纯化了一种新的
杀虫蛋白———GE/&，该蛋白对大蜡螟 6$))./+$ (.))’&.))$具有高血腔注射活性，对大蜡螟(龄幼虫的QR
(&
为*’S(/ #:T头。本文检测了该毒素对大蜡螟幼虫的致病特性，注射GE/&毒素后，大蜡螟幼虫表现出兴
奋和痉挛等症状，当以不低于（H&U&S&%）#:T头的剂量注射GE/&，大蜡螟幼虫均在%& 57#内死亡，但试虫
的体色、血淋巴的颜色以及血细胞的形态没有发生明显的变化。对大蜡螟体内酶活性的测定结果显示，
在注射QR 剂量的GE/&蛋白后，试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照（7V&S&(），
(&
而酚氧化酶活力显著低于对照（7V&S&(）。对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示：这种/% WR6蛋
白能够破坏试虫的中肠组织，导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。据此推测，GE/&与嗜
线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关，寄主中肠组织可能是其作用靶标之一。
关键词：嗜线虫致病杆菌；血腔毒素；酶活力；大蜡螟；中肠
中图分类号：X1*( 文献标识码：? 文章编号：&/(/0*%1（* %&&’）&*0&*&)0&’
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(&
基金项目：国家自然科学基金项目（2&/&&%1*）；河北省自然科学基金项目（3%&&*&&&//2）；河北农业大学重点基金项目（1’)*）
作者简介：杨君，男，)1’)年生，河北人，硕士研究生，研究方向为昆虫病原微生物，405678：96#:%%)’);)*2<=>5
!通讯作者?"@A>BC>B=>BB$DE>#F$#=$，G$8<：’*02)%0H(%’)(&；I6J：’*02)%0H(%’)*&；405678：KL7#97#:;96A>><=>5<=#
收稿日期 M$=$7N$F：%&&H0))0)/；接受日期 ?==$E@$F：%&&’0&(0)/
U8G 昆虫学报 54*(6’*&#&%&7-4(3-’-4( ?M卷
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虽然各种昆虫都拥有体液免疫和细胞免疫的保 共生菌。前期研究已经从其细胞内分离纯化了G种
护（E/%-+$ /+. F4&/+.，G88G），但还是有各种微生物能 杀虫蛋白，其中一种分子量约为U8 <T/的蛋白对大
够成功地对付这种先天免疫反应，成功地侵染寄主 蜡螟具有较高血腔注射活性（王勤英等，G88?）。在
昆虫（F*&$04*/ /+. H-;，G88I）。嗜线虫致病杆菌 对该菌株的进一步研究中，又从其细胞内纯化了一
)$’&.,(/012 ’$#(*&+,-%( 属 肠 杆 菌 科（J+4$&"C/39 种新的对大蜡螟具有高血腔注射活性的蛋白，其对
4$&-/3$/$），革兰氏阴性细菌，与小卷蛾斯氏线虫 ?龄大蜡螟幼虫的血腔注射致死中量（ET ）为US>?7
?8
3*$-’$.’$#( 4(.+&4(+2($ 共生（K<*A&04 /+. L"$;/&$， +BV头。该蛋白分子量约为 7G <T/，命名为 6’78
MNN8）。侵染期的昆虫病原线虫能够将携带的共生 （6",-+ ’&"4$-+ 78）。6’78 蛋白编码 PUS 个氨基酸残
菌释放到靶标昆虫血腔内，并在短期内杀死寄主昆 基（O$+L/+< 登录号：KLWUS7MS）（杨君等，G88S），与
虫。在昆虫病原线虫9共生菌复合体的杀虫过程中， 已知6,’78 蛋白（KLLGN7S8）存在 G 个氨基酸差异，
共生菌扮演着重要的角色，它们能够在靶标昆虫血 本文主要针对这种新蛋白的杀虫机理进行初步
腔内繁殖，分泌各种毒素，抑制其免疫反应，最终使 探讨。
靶标昆虫患败血症死亡（1/&< /+. H-;，G888；
2#A/;/，G88M）。 ) 材料与方法
昆虫病原线虫9共生菌复合体具有广泛的寄主
范围，已经被用来防治各种地下害虫及钻蛀类害虫 )*) 供试菌株和试虫
（H/)/ /+. O/AB($&，MNNP）。作为杀虫的主导因子，共 嗜线虫致病杆菌 !LPM8 菌株、? 龄大蜡螟
生菌产生多种与杀虫活性相关的毒素，但这些毒素 "(%%$.-(#$%%&’$%%( 幼虫（体重 8>G8 X 8>G? B）均由河
在昆虫病原线虫9共生菌复合体杀虫过程中的具体 北农业大学害虫生物防治实验室提供。
作用还不清楚。对嗜线虫致病杆菌杀虫毒素的不断 )*+ 胞内蛋白提取
研究，将有助于揭示昆虫病原线虫共生菌的杀虫机 参照王勤英等（G88?）的方法。将培养好的菌液
理，为新的微生物杀虫资源的开发利用提供理论依 在7Y，M8888 & V;-+离心P8 ;-+，所得细胞沉淀加适
据。现在已从不同的昆虫病原线虫共生菌中分离到 量的磷酸缓冲液（’*"0’*/4$ CA55$& 0"(A4-"+，1LF），7Y
了多种具有杀虫活性的物质，根据其作用方式可分 S888 &V;-+离心洗涤并用 1LF 重新悬浮，经超声波
为口服活性和血腔注射活性两类，具有血腔活性的 破碎和离心后，上清液再用8>7? ; 滤膜过滤，最后
!
物质被认为在杀虫过程中起主要作用（55&$+3*9 由Z-((-’"&$ P <T/ Q$+4&-3"+ [Z9P离心超滤管浓缩获
Q"+04/+4 $* (%@，G88I）。目前，有关昆虫病原线虫共 得胞内蛋白粗提物。
生菌血腔毒素方面的报道还不是很多，研究较深入 )*, 血腔毒素的纯化
的有来自发光杆菌 !,&*&.,(/012 %1#-’$24$’2 RM7 菌 )*,*) 血腔毒素 6’78 蛋白的分离纯化：用 P8\硫
株的 63 毒素蛋白（L"#$+ $* (%@，MNNS；L(/3<CA&+ $* 酸铵盐析对M>G节中的胞内蛋白提取物进行初步分
(%@，MNNS；OA" $* (%@，MNNN；55&$+3*9Q"+04/+4 /+. 离，透析（7Y）后再经过 +/4-%$91KOJ 制备型凝胶电
L"#$+，G88M）、;35 基因表达产物（T/C"&+ $* (%@， 泳进一步纯化。蛋白质条带的定位及样品的洗脱：
G88G），以及来自嗜线虫致病杆菌的 6,’78毒素蛋白 从胶板的两边各切下一个泳道的胶条，用考马斯亮
（L&"#+ $* (%@，G88U）和溶血素（L&-((/&. $* (%@，G88M）等。 蓝染色 P8 ;-+，剩余的胶片用保鲜膜密封保存于
嗜线虫致病杆菌 !LPM8 菌株是本实验室从来 7Y。根据染色胶条上 6’78 蛋白条带位置，从未染
自河北省土壤的线虫体内分离得到的昆虫病原线虫 色的胶片上切下相应位置的条带，加液氮充分研碎
E期 杨 君等：嗜线虫致病杆菌血腔毒素T1$(对大蜡螟幼虫体内酶活和中肠组织的影响 E(.
后再加入适量的 !"#缓冲液，$% &’ ((( ) *+,-离心 &= &(Z$ +20*C毒扁碱）与(KD +C (K($ +20*C 1R IK(
.( +,-除去凝胶碎片，回收上清液用 /,00,12)3 . 456 磷酸缓冲液混合，加入(K& +C酶液后在.(%中水浴
73-8),92- :/;. 离心超滤管透析浓缩，最后经 <= .( +,-，再加入& +C显色剂（B=十二烷基硫酸钠溶
-68,>3;!?@A和&’= #5#;!?@A进行鉴定分析。 液和&=坚固蓝 "盐溶液以BX’的比例混合），室温
!"#"$ 血腔活性测定：毒素分离提纯过程中活性的 静置.( +,- 后测定其 M5 值。根据";萘酚标准曲
E((
监测采用注射法。用微量进样器（/7：’B!C）将待 线（与显色剂结合后，";萘酚浓度与 M5 值呈线性
E((
测样品B!C 从 B龄大蜡螟幼虫的第一对腹足之间 关系）计算出每毫升酶液生成的";萘酚数，结合酶液
注入血腔，将注射后的试虫放在铺有滤纸的培养皿 蛋白含量计算其比活力，用";萘酚!+20（* +,-·+L）表
（直径 D 9+，&( 头*皿）中。对照组注射同等剂量的 示。每个处理重复.次。
!"#样品，每个样品 . 次重复，每个处理注射 .( 头 !"&"% 多酚氧化酶活性的测定：参照 PSF66N6 和
试虫。注射后放在 ’E%培养箱中，每隔 E F检查大 76S,G（6 &DI$）的方法并略作修改。在 &KB +C (K(B
蜡螟的死亡情况和症状，连续观察 $< F，记录其体 +20*C 1REK<的磷酸缓冲液中加入&KB +C(K’ +20*C
色、行为等方面的变化。 邻苯二酚作为底物，再加入 (K& +C酶液混匀，’B%
!"#"# 蛋白含量的测定：使用 ")6GH2)G（&DIE）蛋白 水浴中振动反应 &B +,- 后，于 $’( -+ 处测定 M5
浓度测定法，以牛血清白蛋白（"#?）作为标准建立 值。根据酶液中蛋白质的含量，酶活力 [用每毫克
标准曲线。 酶液每分钟所引起的 M5值变化表示［[：M5（* +,-·
!"#"% J68,>3;!?@A 和 #5#;!?@A：电泳方法、电泳 +L）］。每个处理重复.次。
缓冲液、染色液和脱色液（考马斯亮蓝染色）的配制 !"&"& 数据统计处理方法：对.种酶活力的测定数
参照郭尧君（’((&）方法。电泳图像的分析应用捷达 据均通过5!#数据处理软件完成。采用5O-96-\S新
凝胶分析软件。 复极差法（! W (K(B），数据均为平均数 ] 标准误
!"% 血腔毒素对大蜡螟血淋巴的影响 （+36-] "#）。
根据 &K.K’ 的方法，以 E<KB$ -L*头（C5B(）的剂 !"’ 中肠组织石蜡切片的制作及观察
量处理试虫。在试虫死亡前分时段（.( +,-，&，’，$， 按照 &K.K’ 的方法，以 C5 的剂量处理试虫。
B(
<，&’，’$，.E和$< F）收集血淋巴并观察。对于血细 参照 &KBK& 取各时段处理组和对照组试虫，在预冷
胞的变化是通过常规涂片和相差显微镜（M0N+1O3 的!"#缓冲液中解剖出中肠，经过布安氏固定液
PQI&）进行观察。 （"2O,-’SH0O,G）（苦味酸饱和液、$(=甲醛和冰醋酸之
!"& 血腔毒素对大蜡螟#种酶活性的影响 比为IB*’B*B）固定、酒精逐级脱水、二甲苯透明、石
!"&"! 试虫处理和酶液提取：采用 &K.K’ 的方法， 蜡包埋（B<% ^ E(%）和组织切片（切片厚度 E ^ <
以E<KB$ -L*头的剂量注射试虫。在第 E，&’，’$，.E +）后，用苏木精;伊红双染法（R3+682_N0,-;A2S,-）染
!
和$< FB个时间点随机采集对照组和处理组存活幼 色封片。使用光学显微（M0N+1OS 7Q.&）照相系统观
虫。在玻璃匀浆器中加入与每种酶相对应的预冷磷
察并拍照。
酸缓冲液（按照每克虫重加入 B +C缓冲液）后冰浴
匀浆。匀浆液离心（$%，&’ ((( )*+,-，’( +,-）后除 $ 结果与分析
去表面的白色絮状物，取上清液作为粗酶液。
!"&"$ 乙酰胆碱酯酶活性的测定：采用 A00+6- 等 $"! 血腔毒素的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
（&DE&）的方法略有改进。在’KE +C磷酸缓冲液（1R 通过.(=硫酸铵饱和度盐析和制备型凝胶电
IK$）中加入 (K& +C 酶液和 (K& +C ?S9F;5TJ" 泳，从嗜线虫致病杆菌 R".&(菌株胞内蛋白提取物
（6938N08F,29F20,-3 G,8F,2;U,S;-,8)2U3-V2,9 69,G，体积比W 中回收到的 T1$(蛋白再经 <= -68,>3;!?@A进行纯
&X’）后，’B%下反应&B +,-，用(KB +C&Y&(Z. +20*C 度鉴定，结果显示本方法获得的 T1$( 蛋白成分单
毒扁豆碱终止反应，于$&( -+下测量光吸收的变化 一，没有其他杂带出现（图&：?）。经&’= #5#;!?@A
值。酶活力以M5（* +,-·+L）表示。每个处理重复 . 分析，T1$(蛋白仍显示为单一条带（图 &："）。根据
次。
标准蛋白/6)43)，应用凝胶分析软件计算 T1$(的分
!"&"# 羧酸酯酶活性的测定：参照 >6- ?S13)3- 子量约为$’ 456。
（&DE’）的方法。B +C .Y&(Z$ +20*C";醋酸萘酯（含
D%$ 昆虫学报 )*+’,&+%"%$%-.*’/.&.*’ F!卷
!"# 血腔毒素对大蜡螟幼虫血淋巴的影响
健康大蜡螟幼虫的血淋巴是浅黄色的（图 I：
0），暴露于空气中会变成黑色（大约 I% K+(）（图 I：
M）；以 H5 的剂量注射 "#$% 的大蜡螟血淋巴也是
F%
浅黄色的（图I：>），与对照无差异，并且暴露于空气
中也发生黑化（图I：5），但黑化时间比对照滞后约!
L。分时段收集大蜡螟幼虫的血淋巴于相差显微镜
下观察，并没有发现"#$%对血细胞的形态造成明显
的影响（图$）。
图! "#$%蛋白&’ ()*+,-./012和!3’ 454./012
6+78 ! &’ ()*+,-./012)(9!3’ 454./012:;"#$%
0："#$% 的 &’ ()*+,-./012 纯度鉴定 &’ ()*+,-./012 :;
#<=+;+-9"#$%；>："#$%的!3’ 454./012分析!3’ 454./012
)()?@A+A:;"#$%8 !："#$%；B：B)=C-=8 图I "#$%对大蜡螟幼虫血淋巴的影响
!"! 大蜡螟幼虫的病症观察 6+78 I "L--;;-Q*:;"#$% :(*L-L-K:?@K#L
以D&EF$ (7G头（H5 ）剂量的 "#$%注射大蜡螟， :; !8 "#$$%&#$$’ ?)=,)-
F%
0：对照新鲜血淋巴M:(*=:?（;=-AL）；>："#$%处理后的新鲜血淋巴
注射后的试虫随即开始快速爬动，表现出兴奋症状；
T-K:?@K#L:;"#$%*=-)*K-(*（;=-AL）；M：对照血淋巴（体外放置I%
IJ$ K+(后大部分试虫运动减少，头胸部翘起，口器 K+(）"L-(:=K)?L-K:?@K#L-U#:A-9*:*L-)+=;:=I%K+(；5："#$%处理
持续一张一合；!% K+(后试虫表现为强烈的痉挛症 后的血淋巴（体外放置3 L）"L- L-K:?@K#L :; "#$% *=-)*-9 ?)=,)-
状，足和口器微颤，体躯前后抽搐，有的扭曲翻滚，最 -U#:A-9*:*L-)+=;:=3L8
后试虫行动缓慢直至死亡。刚刚死亡的试虫身体发
软但无脱水现象。与对照组相比，体色不发生改变
（图3：0和 >）。继续放置 D L 后，试虫身体从其头
部到胸部变黑，但身体其他部分不变色（图 3：M 和
5）。当以不低于（N%O%E%3）(7G头的剂量注射 "#$%，
大蜡螟幼虫均在3% K+(内死亡。
图$ "#$%对大蜡螟幼虫血细胞的影响
6+78 $ "L--;;-Q*:;"#$% :(*L-L-K:Q@*-A
:; !8 "#$$%&#$$’ ?)=,)-
0：对照血细胞 M:(*=:?；>：注射 "#$% 后 !3 L 的血细胞 "L-
L-K:Q@*-A:; !E "#$$%&#$$’ ?)=,)-+(R-Q*-9S+*L"#$%)*!3L8
!"$ 血腔毒素对大蜡螟幼虫体内#种酶活性的影响
以 "#$%蛋白的致死中量注射大蜡螟F龄幼虫，
图3 大蜡螟幼虫注射"#$%后的体色变化 然后对幼虫体内羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和多酚氧
6+78 3 ML)(7-:;*L-P:9@Q:?:=);*-=+(R-Q*+(7"#$%
化酶的活性变化进行了测定。结果显示，在处理后
+(*: !8 "#$$%&#$$’ ?)=,)-
!3JID L，"#$% 对大蜡螟体内羧酸酯酶的激活作用
0：对照M:(*=:?；>：注射 "#$%后刚死亡的大蜡螟幼虫 "L- ;=-AL
显著（(V%E%F），并且活性表现为随时间增加而增
Q)=Q)A-A:; !8 "#$$%&#$$’ ?)=,)-+(R-Q*-9 S+*L "#$%；M，5：注射"#$%
死亡后DL的大蜡螟幼虫DLQ)=Q)A-A:; !8 "#$$%&#$$’?)=,)-+(R-Q*-9 高（图F）；"#$%对乙酰胆碱酯酶的激活作用更加明
S+*L"#$%8 显，在所取样的 F 个时间点中，"#$% 处理组与 />4
处理组都表现出显著差异（( V%E%F）（图 D）；但是，
K期 杨 君等：嗜线虫致病杆菌血腔毒素!"#$对大蜡螟幼虫体内酶活和中肠组织的影响 K$-
!"#$蛋白对于多酚氧化酶的活性显示出较高的抑 !"# 血腔毒素对大蜡螟幼虫中肠的影响
制作用，除了处理后 %& ’外，其余时间点处理组幼 用()*和 !"#$蛋白分别注射-龄大蜡螟幼虫，
虫体内多酚氧化酶的活性明显低于 ()* 对照组（! 通过对不同处理和不同时间进行中肠取样，经组织
+$,$-），并且从第 %& ’开始 !"#$ 的抑制作用有越 切片显微观察发现：()* #N ’ 处理组（图 N：L，其余
来越强的趋势（图.）。 时间段 ()*处理的大蜡螟幼虫中肠与 #N ’ 基本一
致）的大蜡螟幼虫中肠细胞排列紧密，围食膜（(O）
清晰可见。在 !"#$ 处理 %& ’（图 N：)）的中肠切片
已经发现部分柱状细胞开始伸长变形，散乱脱落。
!"#$处理&# （’ 图 N：3）围食膜消失，肠壁细胞极度
拉长变形，病变加重。到#N （’ 图N：F），中肠发生完
全病变，中肠细胞排列紊乱，大量细胞脱落。
$ 讨论
图- 大蜡螟-龄幼虫在不同时段羧酸酯酶活力的变化
嗜线虫致病杆菌一旦进入到昆虫血腔，首先需
/012 - 34564780908:0; "2 #$%%&’$%%( <4594=
要克服昆虫的免疫反应，然后开始增殖并产生多种
0;>=78=?@08’!"#$ 4;?()*
柱上不同字母表示差异显著)45 5="5=A=;8AB=4; C )*（’DE）, 毒素，在短时间内就会引起昆虫死亡。)H@=; 等
F0GG=5=;8<H@=574A=<=88=5A0;?0748=A01;0G074;8?0GG=5=;7=AI=8@==;?0GG=5=;8 （%PPN）从发光杆菌 !2 %+#,’$-.$’- Q%# 的胞外分泌
85=48=?<4594=（!+$,$-，J*F）；下图同!’=A4B=I=<H@2 物中分离纯化出一种高分子量蛋白复合物———!7
毒素，该蛋白复合物同时具有血腔注射和口服杀虫
活性。随后，与编码 !7蛋白类似的 R"8杀虫基因簇
又从 /2 ’$#(0&12,%( 中被发现了（OH514; $0 (%2，
&$$%；*=51=4;8 $0 (%2，&$$E），其编码的 S"8蛋白也是
大分子蛋白复合体，但是 S"8 没有表现血腔注射活
性。因为自然状态下，共生菌产生的任何胃毒素都
被认为应该在昆虫血腔一侧起作用，所以到目前为
止仍然不清楚S"8在嗜线虫致病杆菌致病过程中所
起的作用。)5H@; 等（&$$#）从嗜线虫致病杆菌 L&#
图K 大蜡螟-龄幼虫在不同时段
中克隆得到 8R"#$ 基因，该基因的表达产物是一种
乙酰胆碱酯酶活力的变化
分子量为#& TF4的蛋白———!R"#$，对大蜡螟幼虫具
/012 K L7’64780908:0; "2 #$%%&’$%%(
有很强的血腔注射活性，与本实验从嗜线虫致病杆
<4594=0;>=78=?@08’!"#$ 4;?()*
菌U)E%$细胞内获得的蛋白 !"#$很相似。Q=A8=5;
I<H880;1 检测结果表明，!R"#$ 与 !"#$ 属于同源蛋
白，由于!"#$蛋白的氨基酸序列（V=;)4;T 477=AA0H;
;WBI=5：L)XKN#%N）与已知 !R"#$蛋白存在&个氨基
酸的差异，所以 !"#$ 应为一种新的蛋白（杨君等，
&$$N）。)5H@;等（&$$#，&$$K）是利用构建粘粒文库
的方法先克隆基因再通过表达获得的 !R"#$ 蛋白。
本研究利用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法先
得到了蛋白后确定基因，现在随着蛋白质组技术的
图. 大蜡螟-龄幼虫在不同时段 发展，从分离纯化蛋白再到确定基因的途径被越来
多酚氧化酶活力的变化 越多的应用（邹勇等，&$$.），特别是类似 !"#$ 这样
/012 . (M4780908:0; "2 #$%%&’$%%( <4594= 的单体蛋白，本文的方法也是具有可操作性的。
0;>=78=?@08’!"#$ 4;?()* 在昆虫体内，酯酶主要负责正常的脂类代谢和
L%L 昆虫学报 4*(’5&(%"%$%0+*’1+&+*’ ;E卷
图! "#$%蛋白对大蜡螟幼虫中肠病理学影响
&’() ! *’+,-#.,/-0-(’1.023321,+-3"#$% #4-,2’5-5,/26’7(8,-3 !) "#$$%&#$$’ 0.49.2
所有图片均为幼虫中肠纵切，标尺长:;!6。<00 ’6.(2+.420-5(’,87’5.0 +21,’-5+,/4-8(/ ,/242(’-5 -3 ,/26’7(8,+-3 0.49.2 ’5-180.,27 =’,/
2’,/24>?@-4"#$%；+1.02A.4B:;!6) <：对照组中肠C-5,4-0；?，C，D："#$%处理E:，:$和$!/的幼虫中肠组织F.49.26’7(8,,’++82+.,
E:，:$.57$!/.3,24"#$%’5G21,’-5，42+#21,’920H) ?I：底膜?.+2625,626A4.52；J：中肠上皮细胞I’7(8,2#’,/20’86；F：肠腔I’7(8,08625；
>I：围食膜>24’,4-#/’16.,4’K)
外源脂类化合物的解毒代谢等。本实验显示注射 此"#$%对昆虫神经系统的影响还有待于进一步研
"#$%的大蜡螟 ; 龄幼虫体内羧酸酯酶活性明显增 究。多酚氧化酶（>N）是昆虫体内很重要的免疫因
强，这与前人测定昆虫病原线虫对大蜡螟体内酯酶 子，在昆虫体内是以无活性酶原 >>N 形式存在的，
活性的影响结果基本一致（丁晓帆等，:%%;；韩冰 当病原体入侵时通过 >>N 级联被活化，与昆虫体内
等，:%%L）。"K#$%的研究表明其对靶标昆虫脂肪体 黑色素的形成有关（时超美，:%%%）。有研究表明寄
具有明显的破坏作用（?4-=5 #( ’$)，:%%L），虽然本研 生性昆虫、昆虫病原细菌和真菌都能够抑制寄主昆
究没有观察到"#$%对脂肪体的明显影响，但是"#$% 虫体内多酚氧化酶的活性（?2245,+25 #( ’$)，:%%%；
处理后幼虫体内酯酶活性的增强间接反映出 "#$% @/20AH #( ’$)，:%%%）。注射 "#$%后，大蜡螟体内多酚
对大蜡螟脂肪体是有影响的。酯酶活性增强表明大 氧化酶的活性受到明显的抑制，大大降低了其免疫
蜡螟体内脂类物质分解活动增强，从而可能引起脂 力，直至试虫死亡也没有诱发黑化反应。对大蜡螟
肪体的结构破坏，导致内部组织解体，加快昆虫死 幼虫血淋巴的观察也证实 "#$% 具有延缓黑化的作
亡。通常乙酰胆碱酯酶被认为是神经毒剂的靶标 用。本研究未能在光学显微水平上观察到 "#$% 对
酶，这类杀虫剂通过抑制其活性而引起靶标害虫兴 大蜡螟幼虫血细胞形态方面的影响，但 "#$%能够在
奋和痉挛，最终麻痹死亡（张静等，:%%M），"#$% 引起 一定程度上降低试虫血细胞的数量。由此，推测
的大蜡螟幼虫的中毒症状如杀虫速度快、痉挛等正 "#$% 可能与共生菌的免疫抑制有关。
好与之基本相符。但是，对试虫体内乙酰胆碱酯酶 许多已知的杀虫毒素如苏云金芽胞杆菌
活性的测定结果却表明 "#$% 对乙酰胆碱酯酶不仅 )’*+$$,-(.,/+&0+#&-+- 的"O内毒素（"O 257-,-K’5+）和来
没有表现抑制作用，反而引起其活性显著增强。因 源于链霉菌 1(/#2(%"3*#- 的胆固醇氧化酶（1/-02+,24-0
=期 杨 君等：嗜线虫致病杆菌血腔毒素4789对大蜡螟幼虫体内酶活和中肠组织的影响 =9Q
!"#$%&’），它们的杀虫作用靶标都是昆虫中肠 1==;0
（()%*+,-./ !" #$0，1223）。已有研究显示，来自昆虫 (.!</>G，N%! @4，M#/’& GC，@+A-.&B CD，G%&B O:，;9980 @ /!?’)
&’*.’B’$7.!B’#/B!"#/6.!EBA’#/&’*B7%BA!H’/#*,%*B’.#-E1!-’)2#3(.+
病原线虫共生菌的多种毒素如 4* 毒素、5*6 毒素、
-!8#"’&2*$#0 ;0 4*’$0 ?2!80，;Q2：18R2RS18=910
4"789毒素等注射到昆虫血腔后都表现出对昆虫中
:%,!./OD，Z%B’.6#’)$ F，>#)?%NO，@- NO[，>A%.E%>，66.’/*AVN!/&B%/B
肠组织的破坏作用（()%*+,-./ !" #$0，1223；:%,!./ !" CM，;99;0 @ &#/H)’ 72’"’)2#3(.+ H’/’，8#@!+ /#"!)&*$$#)+ <$’&&>
#$0，;99;；(.!</ !" #$0，;998，;99=），本实验也观察 （8/<），%))!<&:+/2!)*/2*#/’$*B!7’.&#&B<#BA#/%/$+#))#/&’*B&0 OF@>，
到了 4789对大蜡螟中肠组织的破坏作用。此外，应 22：19Q8;S19Q8Q0
用绿色荧光蛋白标记的方法也证实嗜线虫致病杆菌 :#/H\P，]#/5>，]#-]>，;99R0 G66’*B&!6’/B!E!7%BA!H’/#*/’E%B!$’&!/
’/’.H’B#* *!/B’/B& #/ A’E!)IE7A !6 A#$$!)*# 8!$$’-!$$#0 ;’.)-#$ ’<
和发光杆菌对海灰翅夜蛾 %&’(’&"!)# $*""’)#$*+ 和烟草
B#-C*-=9=)*/.$".)#$D-*6!)+*">，;3（U）：8US8Q0［丁晓帆，林茂松，
天蛾 ,#-(./# +!0"# 幼虫中肠上皮细胞具有亲和性 刘亮山，;99R0 几种昆虫病原线虫对大蜡螟幼虫血淋巴及其能
（>#)?% !" #$0，;99;；>#*%.$ !" #$0，;998）。由此推断昆 源物质含量的影响0 南京农业大学学报，;3（U）：8US8Q］
虫病原线虫共生菌的作用靶标可能位于昆虫中肠。 G))E%/K]，N!-.B/’I L:@，@/$.’&^D.，P’%BA’.>B!/’ C5，12=10 @/’<
但是，无论是 4789 还是 4"789均未表现出口服杀虫 %/$ .%7#$ *!)!.#E’B.#* $’B’.E#/%B#!/ !6 %*’BI)*A!)#/’&B’.%&’ %*B#?#BI0
4*’/2!80 72#)8#/’$0，Q：33S2R0
活性（未报导），即该类毒素在消化道内不能发挥其
66.’/*AVN!/&B%/B C，:!<)#/H F，Z%B’.6#’)$ @C，;99Q0 J/&’*B#*#$%) B!"#/&
破坏中肠消化道的活性，只可能与消化道内的环境
6.!E 72’"’)2#3(.+ ,%*B’.#% %/$ BA’#. 7!B’/B#%) -&’ #/ %H.#*-)B-.’0
有关。杨君等（;993）的研究结果显示出 4789 是不 E’0*/’-0，82：8U=S8R10
被分泌到细胞外的。那么，这种只存在于细胞内的 66.’/*AVN!/&B%/B CM，(!<’/ :D，;9910 F!?’) #/&’*B#*#$%) B!"#/& 6.!E
杀虫蛋白是如何起到杀虫作用的呢？我们推测 /’E%B!$’V&IE,#!B#*,%*B’.#%0 ?!$$,’$0 F*<!%/*0，RQ：3;3S3UU0
4789可能是通过细胞自溶被释放到昆虫血淋巴中 K-!]F，P%B#HCW!，W..K]，>*A%6’.(Z，>B.#*+)%/$D@，>-+A%7#/$%L，
Z!!$&<!.BA @4，O’B’)) DL，12220 72’"’)2#3(.+ $.8*-!+/!-+ ZV18
的。到目前为止，昆虫病原线虫共生菌对寄主昆虫
#/&’*B#*#$%)%*B#?#BI*!/&#&B&!6%B)’%&BB<!&#E#)%.,-B$#&B#/*B7.!B’#/&0
的致病机理还不是很清楚，对这类毒素的深入研究
O-.#6#*%B#!/ %/$ *A%.%*B’.#X%B#!/ !6 B!"#/ @ %/$ B!"#/ (0 ;0 4*’$0
将有助于揭示昆虫病原线虫共生菌与寄主昆虫之间 ?2!80，;Q8：23U=S238;0
的关系。 K-![D，;9910 G"7’.#E’/B%)4’*A/#T-’!6 O.!B’#/ G)’*B.!7A!.’&#&0 >*#’/*’
O.’&&，(’#_#/H0 R8S1RQ0［郭尧君，;9910 蛋白质电泳实验技术0
参 考 文 献（!"#"$"%&"’） 北京：科学出版社0 R8S1RQ］
M%/ (，N!/H (，]#- [N，P- M(，;99=0 G66’*B !6 BA’ $#66’.’/B
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J/：K%-H)’. C，L%I% ML ’$&0 G/B!E!7%BA!H’/#* F’E%B!$’& #/
A#$$!)*#8!$$’-!$$#0 ;’.)-#$ ’< 9-2.* 9=)*/.$".)#$ %/*!-/!+，U8（Q）：
(#!)!H#*%)N!/B.!)0 N0C0N0 O.’&&，(!*%C%B!/，P)!.#$%0 QRS290 1U2U，1U2=0［韩冰，从斌，刘亚臣，付海滨，;99=0 不同品系昆
(’’./B&’/ (4，D%E’& @@，NA.#&B’/&’/ (5，;9990 K’/’B#*& !6 E!&T-#B! 虫病原线虫对大蜡螟羧酸酯酶活性的影响0 安徽农业科学，U8
?’*B!.*!E7’B’/*’0 ,*/)’3*’$0 ,’$0 4*’$0 5!60，=8：11RS1UQ0 （Q）：1U2U，1U2=］
()%*+,-./5，K!)-,’?%G，(!<’/:，66.’/*AVN!/&B%/BCM，12230 @/!?’) J&A%%I%J，N%&#$%DG，12Q80 :#’B%.I4M=989%)B’.&*!E7!&#B#!/%/$’/XIE’
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C，66.’/*AVN!/&B%/B CM，12230 J/&’*B#*#$%) B!"#/&6.!EBA’,%*B’.#-E ]%?#/’5:，>B.%/$5C，;99;0 J/&’*BA’E!*IB’&%/$BA’#..!)’#/#EE-/#BI0
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A4O 昆虫学报 15-’2#-$,$0$8/5’6/#/5’ MN卷
!"#$"%&’ (，)%##"’’ *，+,-."/ (，(0#$%& )12，34456 7&’"#%8’90&- 0: 0: 9&-"8’989;%. =#0’"9&- :#0> !"#$%&’()*+ #",’-$.&/0’ \K5N4 %&;
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*(?73@A6 1..06 2#3/%$#6 4/5%$(/$06，A@（A）：55BBC55B@6 （5）：5M5C5MO6［王勤英，南宫自艳，陆秀君，李秀花，李国勋，
!D#"-’D%!，E9> F，344G6 1& "&’0>0=%’D0$"&98 H%8’"#9,>，!"#$%&’()*+ 崔龙，344M6 嗜线虫致病杆菌\K5N4菌株杀虫蛋白的纯化及活
#",’-$.&/0’，9&D9H9’- D">08/’" =D%$08/’0-9- 0: 6.$)$.-"%’ "7/8*’ H/ 性鉴定6 昆虫学报，BO（5）：5M5C5MO］
9&D9H9’9&$=D0-=D0.9=%-"1 6 96 :#3"%-"(%6 ;’-&$06，@A：ABCG46 F%&$ )，2%&$ ]F，!0&$ *，U%&X0&$ ^F，P,9 T，E0&$ ??，?"&$ !!，
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!D".H/E!，1;"/"/" +1，+I0’JE0’H"# K(，2"HH K1，34446 *%#%-9’9->J 344O6 *,#9:98%’90& %&; 8D%#%8’"#9L%’90& 0: D%">080". 9&-"8’989;%. Q=B4
.9&I";H.08I0:D0-’=.%->%>".%&9L%’90&6 96 :#3"%-"(%6 ;’-&$06，GM： :#0> !"#$%&’()*+ #",’-$.&/0’6 15-’ 4/5%$(/$0$8/5’ 6/#/5’，BO（M）：
3NOC33M6 AGGCAO56［杨君，王勤英，宋萍，南宫自艳，崔龙，孔繁芳，冯
!D9 P(，34446 QD" %8’9R%’90& %&; %==.98%’90& 0: =#0=D"&0.0<9;%-" 9& 姗姗，344O6 嗜线虫致病杆菌血腔毒素Q=B4的纯化和特性分
9>>,&9’/6 2#-$,$0$8/5’0<#$=0")8"，5G（M）：5N4C5NB6［时超美， 析6 微生物学报，BO（M）：AGGCAO5］
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!98%#;(，K#,$9#%#;JS98%,;E，*%$"-!，T%&09-1，K0">%#"UV，K#"DW.9& 1Q*%-"-6 15-’2#-$,$0$8/5’6/#/5’，M4（A）：MGBCMGG6［张静，冯
(，X9R%,;%& 1，344B6 !’%$"- 0: 9&:"8’90& ;,#9&$ ’D" ’#9=%#’9’" 岗，马志卿，冯俊涛，张兴，344G6 细辛醚对粘虫幼虫的毒力及
9&’"#%8’90&H"’Y""& !"#$%&’()*+#",’-$.&/0’，9’-&">%’0;"R"8’0#，%&; 几种重要酶系的影响6 昆虫学报，M（4 A）：MGBCMGG］
9&-"8’D0-’-6 1..06 2#3/%$#6 4/5%$(/$06，G4：ABG5CABO46 ^0,F，\0, F，T9, \T，2%&$ TF，_9% ]F，344G6 QD" %==.98%’90& 0:
!9.R%P*，2%’"#:9".;US，Z%H0#&*)，Z"%&*，PD9.R"#Q，1,P*F，!D%#>% =#0’"0>98-9& -’,;/9&$ 0& =#0’"9&- 0: 9&-"8’6 @"=+0"--"% $A 6"%/5*0-*%’0
!，*0’’"# [，S"/&0.;- !V，::#"&8DJP0&-’%&’ S\，34436 K%8’"#9%. 65/"#5"，3G（3）：3NC3G6［邹勇，侯勇，刘鸿丽，王凌燕，夏庆
9&:"8’90& 0: % >0;". 9&-"8’：;&$-$%&’()*+ 0*,/#"+5"#+ ’#) 4’#)*5’ 友，344G6 蛋白质组学方法在昆虫蛋白质研究中的应用6 蚕学
+"7-’6 >"004/5%$(/$06，B：53@C55@6 通讯，3G（3）：3NC3G］
R%&1-="#"&E1，N@A36 1-’,;/0:D0,-":./"-’"#%-"-H/>"%&-0:%-"&-9’9R"
80.0#9>"’#98>"’D0;6 96 :#+"5-;&?+/$06，O：B4NCBNA6 （责任编辑：赵利辉）
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